柚皮素抑制小鼠骨骼肌急性钝挫伤后纤维化

郭诗哲孙亚英刘少华陈世益陈疾忤

1复旦大学附属华山医院内分泌科，复旦大学内分泌糖尿病研究所（上海200040）2复旦大学附属华山医院运动医学科（上海200040）

柚皮素抑制小鼠骨骼肌急性钝挫伤后纤维化

郭诗哲1孙亚英2刘少华2陈世益2陈疾忤2

1复旦大学附属华山医院内分泌科，复旦大学内分泌糖尿病研究所（上海200040）2复旦大学附属华山医院运动医学科（上海200040）

目的：了解腹腔注射SMAD3抑制剂柚皮素对小鼠骨骼肌急性钝挫伤后纤维化的影响。方法：72只7～8周龄C57bl/6小鼠（20～24 g）随机分为4组，每组18只。包括正常对照组（A组）、普通损伤组（B组）、损伤后二甲基亚砜（DMSO）注射组（C组）、损伤后柚皮素注射组（D组）。B、C、D三组均用自制打击装置制造右侧胫骨前肌中段急性钝挫伤模型；C、D组分别腹腔注射单纯DMSO溶液、柚皮素DMSO溶液，1次/天，直至伤后28天取材。所有小鼠处死取材后，Western Blot方法检测4组小鼠右胫骨前肌SMAD3、pSMAD3、CollagenⅠ、α-SMA的表达；HE及Masson染色评估胫骨前肌的组织学变化；电生理学方法检测各组小鼠胫骨前肌快速颤搐收缩和强直收缩能力，以了解小鼠损伤骨骼肌力学性能恢复情况。结果：1）B、C、D组所有损伤后小鼠骨骼肌中SMAD3表达均高于A组，B、C组pSMAD3表达升高，D组SMAD3以及pSMAD3的表达低于B、C组；2）B、C、D组中CollagenⅠ与α-SMA水平高于A组，但D组的CollagenⅠ与α-SMA水平低于B、C组；3）HE染色发现，损伤骨骼肌中间质较正常组增多，Masson染色证实B、C、D组急性钝挫伤后骨骼肌出现明显纤维化，但D组的骨骼肌纤维化面积显著低于B组和C组；4）损伤后骨骼肌快速颤搐收缩与强直收缩能力显著下降，但D组明显优于B、C组。结论：SMAD3抑制剂柚皮素可抑制骨骼肌损伤后的SMAD3磷酸化水平，改善纤维化，减轻疤痕生成，从而促进骨骼肌损伤修复，提高骨骼肌损伤后的愈合质量。

骨骼肌；钝挫伤；纤维化；柚皮素；SMAD3

急性骨骼肌损伤在运动损伤中常见。损伤骨骼肌有强大的自我修复能力，但纤维沉积的速度要快于肌肉再生，故损伤后期纤维化不可避免[1]。伴有纤维化的骨骼肌的生物力学特性较差，容易发生再次损伤，从而影响运动能力[2]。当前临床上的治疗办法普遍集中于肌肉损伤及出现纤维化后减小纤维化对肌肉特性的影响，如拉伸或康复锻炼，并不能从根本上减少细胞外胶原沉积以及纤维化的过程，故治疗效果有限[3]。

转化生长因子（TGF-β）在骨骼肌纤维化的发生发展中发挥了重要作用[4]。现已证明，TGF-β1可促进其下游蛋白SMAD3的磷酸化，从而上调细胞外基质Col⁃lagenⅠ与间质细胞标志物α-SMA的表达[5]。有研究显示，与正常小鼠相比，在经过致病因素诱导后，缺乏SMAD3蛋白的小鼠中受损组织纤维化程度降低[6]。因而若能够干扰SMAD3的表达或磷酸化，则可能起到改善骨骼肌纤维化的作用。

柚皮素是近年来从葡萄柚中提取出来的一种成分，具有多种药理作用，如抗炎、抗纤维化、保护血管内皮等作用[7]。研究显示，在TGF-β/SMAD纤维化信号通路中，柚皮素可以特异性抑制SMAD3表达以及磷酸化，从而削弱因该信号通路所导致的纤维化[8]。目前，尚缺乏柚皮素在骨骼肌损伤中的应用研究。本实验利用柚皮素治疗小鼠急性骨骼肌钝挫伤，以期减轻骨骼肌纤维化，改善受损骨骼肌的质量。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及造模

7～8周龄雌性C57bl/6小鼠共72只（体重20～24 g），由中国科学院上海实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2009—0019。按国家标准啮齿类动物饲料饲养于复旦大学动物实验部。自由摄食饮水。动物房温度约22℃。相对湿度约50%。

将72只小鼠随机分成4组，每组18只，即正常对照组（A组）、普通损伤组（B组）、损伤后DMSO注射组（C组）、损伤后柚皮素注射组（D组）。我们采用成熟的骨骼肌钝挫伤造模方法对实验小鼠造成骨骼肌钝挫伤[9]。用重物高空垂直下落法造成打击伤，损伤部位为小鼠右胫骨前肌中段。打击前用1%水合氯醛（3 ml／100g）腹腔注射麻醉小鼠，然后将小鼠后肢于伸膝、踝背屈90°位置上进行固定，致伤物为一装有一定量水的50 m l离心管。打击面半径约为0.2 cm，打击物质量为55.7 g，从33 cm高空垂直下落。B、C、D组小鼠在接受重物打击伤造模后，自伤后第1天开始，C、D组分别腹腔注射1%二甲基亚砜（DMSO）溶液、柚皮素溶液（将纯度95%的柚皮素溶解于1%DMSO溶液中，配置成饱和溶液。柚皮素腹腔注射量为0.2 mg/100 g[10]），柚皮素购于上海古朵生物公司。注射频率为1次/天，直至伤后第28天[10]。72只小鼠饲养28天内，所有小鼠饮食活动未出现明显异常，无小鼠死亡。

1.2 取材及处理

所有小鼠在伤后第28天颈椎脱臼法处死。每组小鼠随机挑选6只，然后立即切开小腿皮肤，切取右侧完整的胫骨前肌标本，保存于10%中性福尔马林中，固定3天后脱水处理并石蜡包埋，进行组织学检测；随机挑选6只，取右侧胫骨前肌保存于液氮中，用于West⁃ern Blot检测；剩余6只小鼠取双侧胫骨前肌用于生理学检测。

1.3 检测方法

1.3.1 Western n B B l l o o t t检测

取出液氮中保存的小鼠肌肉组织，使用无菌手术刀于干冰上切取150 mg大小，置于1.5 ml无菌离心管，加入0.5 ml 4°C预冷的蛋白裂解液。用剪刀剪碎组织后，用电动匀浆器进行组织匀浆，后应用超声波细胞粉碎器裂解组织中的蛋白。4℃，12000 rpm离心30 min后取上清液测蛋白浓度，加入5 X Loading buffer变性蛋白，100°C煮沸5分钟。后将蛋白样品置于SDSPAGE电泳分离，转PVDF膜。用5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭PVDF膜1小时，加入一抗SMAD3（美国San⁃ta Cruz公司），pSMAD3（美国Santa Cruz公司），Colla⁃genⅠ（ColⅠ）（美国abcam公司），α-SMA（美国ab⁃cam公司），以及GAPDH（美国Cell Signaling Technolo⁃gy），用TBST稀释。4°C过夜。洗膜后加入二抗（美国Cell Signaling Technology）在常温下反应1小时后，ECL发光法检测各个蛋白表达。Western结果重复3遍。用Image J软件对各个条带灰度值进行半定量分析。将各组间目的条带与内参条带灰度值的比值进行比较，最终确定Western Blot结果是否存在显著差异。

1.3.2 组织学检测

取包埋胫骨前肌的蜡块，于肌肉中间部分垂直于纤维方向切片，切片层厚10μm，每个骨骼肌标本取6张切片，随后各取3张切片分别按HE染色（南京建成生物工程研究所有限公司）和Masson染色试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）说明书操作进行染色。用光学显微镜（IX71SBF2，日本奥林帕斯公司）观察，用DP72软件（日本奥林帕斯公司）采集照片。每张切片在200倍镜下随机观察3个视野，记录并比较各组小鼠纤维化（胶原）面积/总面积的比值差异。

1.3.3 生理学检测

将双侧下肢胫骨前肌放入恒温水浴槽中，并浸泡于Krebs液（NaCI 113、KCl 4.7、CaCl21.25、Mg2S04 1.2、KH2P04 1.2、NaHCO325.0、葡萄糖11.5，单位mmol/L）中，将肌纤维一端固定于水浴槽底部，另外一端固定于张力传感器上，再将信号传输至生物信号采集处理系统仪器。测试前先调试机器，然后将肌肉调整至最适初长度，初始张力为20 mN，平衡20 min后，电刺激胫骨前肌。记录双侧肌肉的快速颤搐收缩和强直收缩力，取其平均值，然后计算损伤侧肌力与健侧肌力的比值，以减小个体差异及操作误差对结果的影响。最终，以对照组肌肉收缩力百分比对各组肌力百分比进行标化，比较各组间比值的差异。

1.4 统计学分析

使用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。采用单因素方差分析对各组间数据进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。当出现统计学意义时，应用图基事后检验（post hoc turkey test）对各组进行两两比较。

2 结果

2.1 Western n B B l l o o t t结果

Western Blot结果（图1）显示，与A组相比，B组和C组的SMAD3、pSMAD3水平增高（P＜0.01，P＜0.001），纤维化标志物ColⅠ以及α-SMA也明显增高（P＜0.05，P＜0.001），而D组的SMAD3、pSMAD、α-SMA以及ColⅠ水平均有所增高但无统计学意义。D组骨骼肌的SMAD3和pSMAD3蛋白表达均低于B、C组两组小鼠（P＜0.05，P＜0.05）。我们进一步验证了纤维化标志物ColⅠ以及α-SMA的表达变化并发现，D组显著低于B组和C组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），说明对钝挫伤小鼠进行柚皮素注射可改善受损骨骼肌的纤维化程度。

图1 各组W estern Blot结果比较

2.2 组织学检测结果

与对照组相比，HE染色结果显示，损伤后小鼠骨骼肌中均出现不同程度的间质增多，间质中出现细胞核呈梭形的成纤维细胞，并有少量炎症细胞聚集（图2，①～④）。Masson染色结果进一步显示，经过钝挫伤造模的三组小鼠受损的骨骼肌标本中，骨骼肌纤维间均出现胶原纤维沉积。但与B、C两组小鼠相比，D组小鼠的骨骼肌胶原纤维沉积更少（图2，⑤～⑧）。对Mas⁃ son染色结果进行定量分析显示（图2，⑨），与A组（1.44%±1.07%）相比，B、C、D组的骨骼肌标本中纤维化面积显著增高（B组35.22%±7.81%，P＜0.001；C组36.56%±6.73%，P＜0.001；D组9.11%±2.77%，P＜0.05），但D组小鼠肌肉中纤维化面积显著低于B组（P＜0.001）和C组（P＜0.001）。

图2 各组组织学检测结果比较（比例尺：100μm）

2.3 生理学检测结果

通过比较各组间肌肉的收缩特性（图3），我们发现，与A组的快速颤搐收缩（100%±5.43%）和强直收缩能力（100%±4.83%）相比，受损伤各组肌肉的快速颤搐收缩（B组49.25%±10.26%，P＜0.001；C组48.5%±8.38%，P＜0.001；D组73.63%±8.41%，P＜ 0.001）与强直收缩能力（B组60.38%±10.80%，P＜0.001；C组61.13%±9.70%，P＜0.001；D组78.5± 8.72，P＜0.001）均有显著下降，但D组的骨骼肌收缩特性显著优于B组（快速颤搐，P＜0.001；强直收缩，P＜0.01）和C组（快速颤搐，P＜0.001；强直收缩，P＜0.01）。

图3 各组生理学检测结果比较

3 讨论

作为经典TGF-β信号通路的一个重要组成部分，SMAD3蛋白是一种受体型SMAD蛋白。在TGF-β受体被激活后，活化的TGF-βI型受体募集SMAD2与SMAD3蛋白结合，在SMAD4的辅助下入核[11]。体内正常生理状况下，SMAD7与SMAD3竞争性结合TGF-βI型受体，起到抑制SMAD3活化入核的作用[12]。现已明确，SMAD3在细胞外基质的表达中发挥了至关重要的作用。与正常小鼠相比，在缺失SMAD3基因的小鼠中，各种致病因素所致的各脏器纤维化均有不同程度的减轻[13-15]。故通过干预SMAD3的表达可起到抑制纤维化的作用。目前对SMAD3的调控可分为直接抑制SMAD3蛋白表达[16]，或通过上调SMAD7表达来减少SMAD3的磷酸化[17]，以及通过抑制SMAD4表达来减少SMAD3入核[18，19]，间接减轻SMAD3对细胞外基质蛋白的上调作用。

本课题组曾就TGF-β/Smad信号通路在骨骼肌纤维化中的作用进行了研究，并发现对Smad4进行干预可在体外及体内水平抑制钝挫伤所致的骨骼肌纤维化[18，19]。由于Smad4参与辅助Smad3入核，但并不调控细胞外基质相关物质的表达，故该研究中我们将干预纤维化的靶点锁定在了能够促进纤维化相关蛋白质表达的Smad3上。已有研究证明柚皮素可以通过抑制Smad3改善组织纤维化，我们通过Western Blot发现柚皮素降低了Smad3以及其活性形式pSmad3的蛋白水平，与前期研究成果一致。

进一步，我们研究了各组间纤维化指标水平的差异。Western Blot结果显示，相较于损伤后未接受柚皮素干预的样本，柚皮素干预后CollagenⅠ以及α-SMA的水平有明显降低，纤维化程度减轻。作为纤维化的两个重要标志物，CollagenⅠ是细胞外基质的主要成分，而在TGF-β诱导的纤维化进程中，另一个重要的变化就是肌细胞向特异性表达α-SMA的肌成纤维细胞转变[20]。因而分析α-SMA的变化有助于更全面了解柚皮素干预对受损骨骼肌的影响。此外，通过组织学分析，我们证实柚皮素干预后的损伤组织中胶原沉积显著减轻，说明柚皮素缓解了急性钝挫伤所致的骨骼肌纤维化。

作为骨骼肌的一个重要生理特性，其收缩能力是评价肌肉质量的重要标准。我们发现，尽管损伤后各组骨骼肌的强直收缩能力与快速颤搐能力均有显著下降，但柚皮素干预组的骨骼肌收缩能力有一定恢复，显示柚皮素对骨骼肌的治疗作用是确切的。

本研究的主要优势在于应用腹腔注射的方法对小鼠进行干预。尽管柚皮素为一种可以口服吸收的植物提取物，但为保证小鼠每日摄入的柚皮素剂量保持一致，我们并未采用其他研究所报道的将药物溶于饮用水的方法对小鼠进行干预。此外，骨骼肌纤维化是一个动态的病理过程，损伤后即每日进行药物注射可以达到对SMAD3的持续抑制作用，便于观察与研究。

本实验也存在一定缺陷。首先，纤维化进程并不是在骨骼肌损伤后即刻启动，受损部位会先出现坏死组织吸收以及骨骼肌再生，故本实验在小鼠骨骼肌受损后立即进行柚皮素干预，尽管保证了药物可以在整个纤维化过程中均起到抑制作用，但也可能会对骨骼肌的再生产生影响。另外，有研究发现，肾脏纤维化的改善程度与柚皮素剂量存在一定的关系[10]，故未来需进一步探究柚皮素剂量与骨骼肌纤维化程度的关联。

4 结论

柚皮素治疗小鼠骨骼肌急性钝挫伤，可通过其对SMAD3的抑制作用，削弱TGF-β纤维化信号通路，从而减轻纤维化，改善骨骼肌的生理学特性。柚皮素是一种具有临床应用价值的骨骼肌损伤纤维化治疗药物。

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Naringenin Inhibits SkeletalM uscle Fibrosisafter Acute Contusion in a M ouseM odel

Guo Shizhe1，Sun Yaying2，Liu Shaohua2，Chen Shiyi2，Chen Jiwu2
1Division ofEndocrinology and Metabolism，InstituteofEndocrinology and Diabetology，Fudan University，Shanghai200040，China 2Division ofSportsMedicine，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai200040，China

Chen Jiwu，Email：jeevechen@gmail.com

Objectives To understand the effect of intraperitoneal injection of naringenin，a SMAD3 in⁃hibitor，on the skeletal muscle after acute contusion in a mouse model.M ethodsSeventy-two mice of 7-8 weeks old（20-24 g）were randomly divided into a control group，an acute contusion（B）group，an acute contusion+1%DMSO injection（C）group and an acute contusion+naringenin injection（D）group，each of 18.The acute contusion model was created by hitting the right tibialis anterior muscle in mice of all groups except the control group.Intraperitoneal injection of 1%DMSO and naringenin were given to group C and D respectively every day until execution，while the 18 mice in the control group were fed without injury or injection.The time of injury was set as Day 0.After being fed for 28 days，all mice were executed and the right tibialis anterior was harvested.Western blotting was used to de⁃tect the difference of SMAD3，pSMAD3，CollagenⅠ，andα-SMA expression among the 3 groups.Hema⁃toxylin-Eosin（HE）staining and Masson staining were used to detect the difference of pathological changes.Moreover，the appearance of fast twitch contraction and tetanic contraction were also document⁃ed to figure out the quality of the injured skeletal muscle.ResultsCompared with the control group，the SMAD3 and pSMAD3 level in injured skeletal muscle increased，but both were less in group D than group B and C.Similarly，the average level of CollagenⅠandα-SMA in all three injury groups was higher than the control group，but the level of these indexes were lower in group D than that in group B and C.HE staining showed more mesenchyme in injury groups than the control group.Mas⁃son staining found the upregulation of fibrosis in injured muscles，with the area of fibrosis in group D significantly lower than group B and C.Compared with control，the injured skeletal muscle had signifi⁃cantly poorer fast twitch and tetanic contraction performance，with the condition of group D significantly better than group B and C.Conculsion The naringenin，a SMAD3 inhibitor，mitigates the phosphoryla⁃tion of SMAD3 after acute contusion in a mouse model.The fibrosis and scar formation was alleviated，hence improving the healing of the injured skeletal muscles.

skeletal muscle，contusion，naringenin，fibrosis

2016.12.28

国家自然科学基金（81472142）

陈疾忤，Email：jeevechen@gmail.com