膝关节韧带组织工程的研究进展

李豫皖 金瑛 熊华章 刘毅

贵州省遵义医学院附属医院骨一科（贵州省遵义市563000）

膝关节韧带组织工程的研究进展

李豫皖 金瑛 熊华章 刘毅

贵州省遵义医学院附属医院骨一科（贵州省遵义市563000）

目的：对目前膝关节组织工程韧带在体内外的研究进展，应用及价值进行综述。方法：查阅国内外近年来关于组织工程韧带构建治疗膝关节韧带损伤的相关应用文献，对包括种子细胞、生长因子和支架材料三大要素对构建膝关节组织工程化韧带的研究进展进行总结。结果：种子细胞、支架材料的筛选和适当的生长因子是构建膝关节组织工程韧带的核心和必要条件。种子细胞培养条件的优化和生长因子的浓度选择及配比是构建良好组织工程韧带的关键，而实现膝关节组织工程韧带在体内存活和更好发挥生物学效用，仍需进一步研究。随着生物医学及材料科学的发展，膝关节组织工程韧带的构建方法及方式在不断改进。

膝关节；组织工程韧带；种子细胞；生长因子；支架材料

人前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）作为限制膝关节前倾，防止胫骨向前过度移位，维持膝关节正常活动与稳定的重要结构，其组织学结构为结缔组织。在膝关节损伤中，前交叉韧带较为常见，其多为撕裂或断裂伤，且运动性损伤在年轻患者中的发病率更高，例如落地、变向、扭转等动作中[1]。由于支配ACL的血管较少，血供较差，因此ACL损伤后一般难以自行修复[2]。据统计，美国每年有30万名新增膝关节前交叉韧带损伤患者，绝大部分患者需要手术重建治疗[3]。目前膝关节前交叉韧带损伤患者大量采用关节镜下ACL重建术，移植物种类较多，包括自体腘绳肌腱、以LARS韧带为代表的人工韧带和同种异体移植韧带等，但重建术后存在诸多并发症，如关节僵硬、肌力下降、移植物免疫排斥反应、重建后移植物断裂，远期并发症如膝关节骨关节炎发生率比正常人群高[4]。除了膝关节前交叉韧带损伤后韧带重建手术方式方法的改进、术后康复及膝关节生物力学机制的探讨以外，对组织工程化膝关节前交叉韧带的研究也是目前研究热点，因为这对于改善韧带重建手术移植物的选择具有重要意义。膝关节组织工程化韧带以生物材料与再生医学为基础，目的在于通过种子细胞经生长因子作用后与支架搭载，使得新生韧带组织达到一定的机械强度并具有相应的生物活性及组织相容性，促进ACL的修复与再生，为膝关节前交叉韧带损伤提供了新型的治疗模式[5，6]。通过查阅近年来相关组织工程化韧带修复和重建ACL的文献，对种子细胞、生长因子和支架材料的研究进展综述如下。

1 种子细胞

由于韧带组织特殊的解剖学结构及其复杂的生物学功能，因此对于构建组织工程化韧带，种子细胞的筛选至关重要[7]。ACL主要由致密的结缔组织构成，以Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及纤维连接蛋白为主（约90%以上），其余为细胞和细胞外基质蛋白构成，细胞外基质蛋白主要以弹性蛋白为主[8]。组织工程种子细胞的筛选是构建膝关节组织工程化韧带非常重要的环节，组织工程化韧带种子细胞主要是成体来源的成纤维细胞，包括韧带细胞、肌腱细胞、肌细胞，其中韧带细胞来源于ACL、髌韧带、内外侧副韧带等；肌腱细胞来源于跟腱、髌腱等；不同组织来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）也是构建组织工程化韧带的重要种子细胞来源[9，10]。

人前交叉韧带成纤维细胞（human anterior cruci⁃ate ligament fibroblast cells，hACLFs）来源于人前交叉韧带，与其他组织来源的成体细胞相比，hACLFs在胶原蛋白合成和免疫排斥方面具有明显优势[11]，Brune等采用形态完整与断裂的ACL组织中提取的韧带成纤维细胞植入支架材料并进行体外培养，研究发现两组的韧带成纤维细胞在形态学、肌动蛋白及韧带基本结构方面无显著性差异，这说明可以使用自身损伤或断裂后的ACL作为种子细胞来源，经体外分离培养后反过来治疗ACL损伤[12]。Nguyen等[13]使用hACLFs来治疗山羊横断性ACL和内侧副韧带损伤，并发现hACLFs作用于韧带断面的胶原纤维的含量显著性上升，组织学特征显示韧带的愈合具有相似的内在愈合反应，断裂载荷显著提高。但hACLFs由于其体外分离培养较困难，培养周期较长，增殖能力较其他细胞弱[14]，因此hACLFs并不能完全充当组织工程韧带最优的种子细胞。

MSC作为近年来组织工程化韧带新兴的种子细胞，相比成体细胞具有诸多优势，MSC具有较强的增殖活性，具有免疫调节、定向归巢功能，具有高丰度、高纯度等特点[15]，并且MSCs具有向成骨、成软骨、成脂及多向分化的潜能[16]，目前已广泛用于骨损伤、骨髓损伤、肝脏、血管损伤等疾病的动物模型体内研究[17-19]。以骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）为代表的MSC已广泛应用于组织工程韧带相关体内外研究。刘毅等研究发现鼠BMSCs可在体外大量增殖，与韧带细胞共培养，经转化生长因子与碱性成纤维细胞生长因子作用后，可向韧带细胞诱导分化，且诱导后细胞增殖能力及活性增加，韧带相关特异性基因表达上调[20]。也有研究证明，BMSCs可在膝关节腔内软骨、半月板及韧带损伤或退变处定向归巢、增殖并向损伤细胞诱导分化，且促进血管生成，降低韧带损伤细胞的凋亡，对损伤组织进行修复再生[21]。Fu等的研究发现，前交叉韧带残端组织中存在有MSCs，这些MSCs具有自我更新及多向分化潜能，在韧带损伤后，这些保留在残端的MSCs可被归巢并迁徙至损伤处进行自我修复及再生，其中一部分细胞还可以向韧带细胞分化，这说明韧带受损后并非不能自我修复及愈合，并且这种来源于前交叉韧带残端组织特异的MSC很有可能作为韧带或肌腱再生过程中理想的种子细胞来源[22]。

由于上述hACLFs本质为成纤维状细胞，属成熟的体细胞，基本无再分化能力，且hACLFs在体外扩增速度较慢，需要在韧带组织培养过程中敏感时期制备细胞，因此对韧带损伤的修复能力有限[23]。然而，MSCs在体外扩增及分化能力较强，随传代次数的增加，可短时间内获得大量细胞，因此使用生长因子及给予不同的体外培养条件，可以让MSCs定向向韧带细胞诱导分化，为韧带的修复再生提供了新思路。

对种子细胞进行不同培养条件及方式培养以满足组织工程构建的需求，是组织工程亟需解决的难题。研究显示对MSC与目的细胞共培养，可以获得活性更高、数量更多的种子细胞，使种子细胞在数量及功能上与目的细胞更相近。Wu等[24]研究通过大鼠BMSCs与肌腱细胞共培养，可显著增加肌腱相关特异性基因的表达和胶原基质的产生，尤其在共培养细胞比例为1︰1或5︰1时，其共培养的细胞形成的细胞膜片可促进大鼠髌腱愈合。Canseco等[25]通过对猪ACLFs与MSC共培养，发现共培养对猪ACL重建有更好的效果，当细胞比例为1︰1时，其Ⅰ、Ⅲ型胶原，细胞连接素（Tenas⁃cin-C）表达有显著性提高。此外，以1︰1比例共培养4周时，Ⅰ、Ⅲ型胶原比例与正常的韧带组织最为相近，因此相对其他细胞培养模式，1︰1比例的共培养模式可促进MSC向hACLFs细胞分化，甚至加快韧带损伤的愈合。Yu等[26]研究显示，通过使用缺氧诱导因子1-α（HIF-1α），采用人受损肌腱细胞与脂肪源性间充质干细胞（ADMSCs）间接共培养，可以提高ADMSCs向肌腱细胞分化，另外在低氧环境下对两种细胞共培养（O2＜2%）可增强分化效果，上调HIF-1α基因的表达，这提示缺氧培养条件下经HIF-1α激活并表达对于ADMSCs向肌腱细胞分化具有重要作用，这为ADMSCs在肌腱再生的体内应用提供了实验基础。Veronesi等[27]通过构建ADMSCs与大鼠肌腱细胞体外间接共培养模型，研究探讨了衰老和雌激素缺乏对肌腱细胞的影响，研究发现老年人的雌激素缺乏可提高肌腱细胞的增殖和治愈率，但相比于正常组的ADMSCs与肌腱细胞共培养诱导效果，老年人雌激素缺乏的ADMSCs其增殖和肌腱相关基因包括COL-Ⅰ、Ⅲ，Scx和Decorin，Tenas⁃cin-C蛋白表达相对较低，作者发现，异体ADSCs在提高肌腱细胞增殖、胶原表达及愈合率方面要高于自体细胞。

利用膝关节韧带细胞与MSCs通过共培养及其他培养条件，可使MSCs处于目的细胞的生长外环境下，并接受目的细胞分泌的细胞因子及建立相关细胞连接，使MSCs更好地诱导生成韧带细胞。此外，将制好的种子细胞搭载在支架上移入受体体内，种子细胞在体内可以释放多种趋化及细胞因子，增强种子细胞在体内的增殖，促进支架与受体相容，促进损伤愈合，并使体内韧带、滑膜细胞向损伤及支架处迁移、增殖，达到体内韧带再生的目的。Parolini等[28]发现MSCs在其分子表型鉴定中低表达组织相容性Ⅰ类抗原，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C，同时也低表达共刺激分子CD14、CD80、CD83、CD86、CD40L等及组织相容性Ⅱ类抗原HLA-DR，这说明MSCs具有较低的免疫原性，不引起或较低度引起同种异体或异种的淋巴细胞增殖反应，即不会或较低度引起免疫排斥及炎症反应，从而保护支架等移植物，强化韧带的修复。

2 生长因子

生长因子在组织修复过程中，常常可以通过调节炎症反应、细胞增殖及细胞转化来提高细胞活性及增强细胞效应；并且生长因子在细胞连接信号的跨膜传导，启动细胞内基因的上调或下调以影响新蛋白的产生，调整细胞增殖、分化、趋化及胞外基质和血管的生成过程方面起着举足轻重的作用，如碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等[29-32]。

bFGF属于与肝素有很强亲和力的生长因子家族，分布于垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺等组织，其中垂体中含量最高，其生物学作用极其广泛，具有促进细胞增殖、向成纤维状分化，促进血管生成及肉芽组织再生作用，且在神经组织生长发育过程中也十分重要，因此对于韧带及肌腱损伤的修复可能具有至关重要的作用[33]。Leong等人[34]的研究评估了组织工程重建鼠前交叉韧带中肝素介导的bFGF的释放，结果显示释放bFGF的支架有更明显的韧带机械应力提高和细胞增殖，相比于无bFGF释放组有显著性差异，这说明应用组织工程的方法对前交叉韧带断裂具有治疗潜力。Chenghao等[35]单独和联合使用bFGF和神经酰胺激活的蛋白磷酸酶（CaPP）对纤维蛋白凝块促进腱骨愈合的影响进行研究，结果显示，经bFGF和CaPP处理后的纤维蛋白凝块，植入到兔跟腱后，细胞增殖加快，腱骨连接更加成熟，相比于未用生长因子处理组，组织学评分更高，骨桥蛋白、碱性磷酸酶、RUNT及相关胶原的mRNA表达水平均有显著提高，bFGF和CaPP加载于纤维蛋白凝块可进一步增强早期愈合。Tang等[36]研究显示，腺病毒超量转染bFGF和VEGF基因后，可有效纠正肌腱损伤后愈合不完全，相比于对照组，可显著提高I型胶原的细胞外分子的生成，加速细胞增殖，提高拉伸力。这些结果表明，生长因子为解决肌腱和韧带内源性及外源性愈合能力不足提供了一种有效的治疗可能。

TGF-β系调节细胞生长及分化的TGF-β超家族。这一家族除TGF-β外，还有活化素、抑制素和骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）。TGF-β这种细胞因子可以使正常的成纤维细胞的表型发生转化[37]，TGF-β有三个亚型，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β 3。相关研究提示，TGF-β可促进成纤维细胞、成骨细胞的增殖生长[38]；TGF-β1和TGF-β2可通过调节IL-6基因转录并促进人成纤维细胞IL-6的产生，调节免疫及炎症反应，抑制免疫活性细胞的增殖，抑制淋巴细胞的分化等[39]；TGF-β1还可促进细胞外基质（ECM）的生成，如胶原蛋白、纤维连接蛋白的表达，抑制ECM降解[40]。金瑛等[41]通过对人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）向膝关节韧带细胞分化，使用TGFβ1和bFGF进行细胞定向诱导，在经过体外诱导后，Ⅰ、Ⅲ型胶原，纤维连接蛋白和细胞连接素等韧带相关特异性基因表达上调，韧带特异性蛋白合成增加。Xie等[42]使用等双轴拉伸模仿机械损伤ACL和内侧副韧带（MCL）成纤维细胞后，使用TGF-β1诱导ACL和MCL编码赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），结果显示LOX可以促进胶原生成及弹性蛋白交联，增加ECM的生成，且MCL中的LOX表达比ACL更高。

BMP作为TGF-β家族的一大成员，其成骨效应已被大量研究证实。Takigami等[43]采用BMP-2联合自体半肌腱对兔ACL损伤行韧带重建术，术后采用组织学和生物力学分析，结果显示在实验组第8和12周时，隧道内的新骨已取代移植的肌腱，并且出现了腱骨交接面处的典型组织学特征。生物力学测试显示12周时，实验组拉伸强度较对照组更大，这说明BMP-2具有成骨效应，可促进腱骨愈合。Ruschke等[44]对不同年龄段的患者进行分级，使用BMP-2在不同时间点刺激体外培养的存在骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者ACL和健康组ACL成纤维细胞，并对Smad和相关基因及关键信号磷酸化蛋白进行检测，发现BMP-2基因介导的Smad1/5/8的磷酸化水平在不同年龄段的患者中存在差异，BMP-2/Smad靶基因如ID1和Smad6与正常组相比要低，这说明BMP-2在延缓ACL退变过程中发挥重要效用。Cheng等[45]研究发现BMP-2与VEGF联合使用可以促进韧带与纤维软骨附着点处的腱骨愈合。Kuroda等[46]在大鼠骨缺损模型中使用BMP-12基因转染重建肌腱及韧带样组织，结果显示，通过2周的BMP-12转基因诱导，转染后的组织纤维化明显，骨形成于第8周，重建8、12周后腱骨愈合良好，说明BMP-12基因转染对肌腱韧带样组织再生愈合有促进作用。

此外，诸多生长因子如PDGF、VEGF、富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）[47]、表皮生长因子（epider⁃mal Growth Factor，EGF）[48]、生长分化因子（growth-dif⁃ferentiation factor，GDF）[49]、胰岛素样生长因子（insulinlike growth factors，IGF）[50]均可促进膝关节韧带组织的修复再生。Komzak研究[47]显示PRP中含有大量的血浆内血小板，其浓度达到106/μL以上，PRP中含有高于正常血浆中5倍左右的生长因子，具有促进细胞及组织愈合的能力。但也有研究提示单独使用PRP对韧带组织的修复能力较弱，因此仍不能作为膝关节韧带损伤最佳的治疗方式，关于PRP最佳剂量、与其他生长因子联合应用的作用时间及使用方法等需要更进一步探讨。Woo等[48]研究发现光固定化EGF诱导人ACL细胞，可促进其快速增殖。Tashiro T等[49]观察使用GDF-5对大鼠MCL间隙损伤的修复作用，结果显示，3周时，韧带强度较对照组明显提高，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达上调，组织中的胶原纤维直径增加，说明应用GDF-5可促进韧带愈合。Herchenhan等[50]研究IGF-1对工程化人肌腱组织中的Ⅰ型胶原合成的影响，发现IGF可补充促进胶原蛋白的形成，对早期肌腱拉伤的荷载具有正性调节作用。

目前用于构建膝关节组织工程化韧带的生长因子种类较多，但作用效果并非一成不变，具有联合性、时效性。通过完善生长因子的控制及释放技术，可达到对韧带损伤更优更自然的修复再生。然而生长因子与种子细胞作用过程中产生的生物相容效应，其内部的分子信号机制很多尚未明了，仍需要进一步研究和探讨。目前在构建韧带组织工程研究中应用较多的生长因子见表1。

表1 生长因子在构建膝关节组织工程韧带中的应用研究

3 支架材料

构建膝关节组织工程化韧带所选择的支架材料应拥有机械强度高，与种子细胞的搭载、黏附、增殖、发挥生物活性等功能，且要与移植物受体存在较好的组织相容性，并能够在生物体内降解以促进韧带细胞组织完全生长，更快地促进膝关节韧带组织再生和修复。用于构建膝关节组织工程韧带的支架材料包括生物材料型支架、可降解合成材料支架、天然材料支架。

3.1 生物材料型支架

生物材料型支架主要由ECM构成，其主要骨架由蛋白质构成，主要来源于人、牛、马等哺乳动物而制成的脱细胞支架（decellularized matrix as scaffold）[51，52]，如肌腱片、心包或真皮组织、小肠粘膜等，这类支架经过去除其他胶原成分，主要保留以Ⅰ型胶原为主（占90%以上）的胶原蛋白[53]。Cheng等[54]的体外实验显示，早期脱细胞真皮支架能够较好地搭载兔ACL细胞并可以保持较快的增殖速度和细胞活性，但随着时间的延长，植入动物体内的支架其附着细胞逐渐减少，支架的机械拉伸能力降低，这说明脱细胞支架其功能并不能完全满足构建膝关节组织工程韧带的需要，甚至出现免疫排斥的风险[55]。此后，Grier等[56]研发出一种胶原-粘多糖复合支架（GAG），并探讨了马肌腱细胞特异性基因的表达和生物活性与改变支架孔径和交联密度的关系，发现支架具有较高的交联密度和较小的孔径能够更好地促进细胞代谢活性，保持并增加肌腱及韧带相关基因的表达。这些结果表明，通过改变支架材料的交联密度和孔隙大小可提高人工肌腱的结构功能和机械拉力。为了提高上述支架的机械性能和生物相容性，研究人员采用特殊的处理方式，如潘娟等[57]制备犬来源的脱细胞肌腱片，用于促进兔肩袖损伤的腱骨愈合，研究发现12周时，损伤的腱骨界面肉芽组织消失，成纤维细胞，Sharpey纤维、新生软骨和软骨细胞数量增多，腱骨界面成熟，说明经反复冻融结合核酸酶处理后制备的犬脱细胞肌腱片可促进兔肩袖损伤腱骨愈合。

天然蚕丝支架作为一种传统的生物材料，其生物相容性良好，在拉伸强度方面与人ACL组织相似，其生物降解速度较慢，可以在生物体内保持基本的拉伸强度不变的条件下达数十月[58]，说明蚕丝支架可较长时间保护膝关节内部韧带的稳定性，为新生韧带细胞和组织提供足够的修复再生时间，让胶原蛋白、纤维连接及血管的生成与自体原有韧带相似。Teuschl等[59]使用蚕丝纤维支架对羊ACL重建的组织学研究发现，新型蚕丝纤维支架能刺激体内条件下ACL再生，重建后细胞增殖提高再生组织的活性，蚕丝纤维含量在6个月时开始明显下降，12个月后基本消失，提示使用蚕丝纤维支架重建ACL可以为膝关节损伤提供新治疗选择。Chen等[60]研究通过Scleraxis基因在人胚胎干细胞来源（hESCs）的MSCs中过度表达与针织蚕丝胶原支架联合构建组织工程化肌腱，发现Scleraxis基因和机械应力的刺激可提高MSCs中肌腱相关特异性基因表达，并且在动物体内肌腱修复模型中机械刺激可促进细胞的重新排列，MSCs在针织蚕丝支架上大量增殖并分化，胶原纤维直径增大，组织学评分和拉伸能力更高。此外，也有文献报道壳聚糖[61]、岩藻酸[62]和透明质酸（HA）[63]等生物材料型支架用于构建膝关节组织工程化韧带。

3.2 可降解合成材料支架

人工合成的可降解材料支架在延展拉伸性能、降解速度、搭载细胞及与支架受体生物相容性方面均有很大的提高。膝关节组织工程韧带研究和应用较多的可降解合成材料为聚乳酸（PLA）[64]及其共聚物（PLGA）[65]、聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）[66]、左旋聚乳酸（poly l-lactic acid，PLLA）[67]等。Toosi等[68]使用胶原-PGA海绵支架搭载BMSCs，结果显示BMSCs在胶原-PGA海绵支架的细胞活力、增殖和分化均有显著提高。扫描电镜显示PGA支架具有连通孔隙，大小为190μm，胶原-PGA海绵支架在BMSCs的细胞黏附、增殖率和成骨分化方面要优于单一的胶原支架，说明PGA支架是在不损害生物相容性的情况下可有效加强胶原海绵支架的效用。Deepthi等[69]使用分层壳聚糖胶原水凝胶与PLLA支架构建纳米纤维屈肌腱组织再生，发现胶原水凝胶经电纺后分层与海藻酸岩凝胶外涂可以防止肌腱的粘连，PLLA支架联合分层壳聚糖胶原水凝胶具有良好的细胞增殖特性，可促进屈肌腱再生，肌腱细胞在支架中附着良好。Pinese等[70]使用PLA-聚环氧乙烯针织支架加强ACL愈合，结果显示ACL在PLA-聚环氧乙烯针织支架中增殖效果良好，具有良好的细胞相容性，通过线形、扭曲、绳状、编织状这4种空间排布，三维编织的针织PLA-聚环氧乙烯支架符合韧带组织的力学性能，可作为韧带重建的支架材料。Khan等[71]采用PLGA-己内酯/L-丙交酯（PLCL）联合支架，通过静态和循环模式体外培养，观察其对韧带组织工程韧带拉伸、扭转相关力学性能的改变，结果发现，PLGA-PLCL在静态条件下定植具有良好的细胞相容性。生物力学测试显示两种支架的降解程度存在竞争关系且降解过程中与水解酶和PLGA的水解作用相关，研究说明PLGA支架的结构与培养环境有很大关系，包括生物相容性和细胞来源等，但PLGA在组织工程韧带中的良好应用必须通过延缓其降解及改进结构来完成。此外还有研究报道多种支架联合[72]，生长因子[73]、生物活性因子[74]与支架联合使用等加强膝关节韧带组织的修复与再生。总之，PLA强度较高，PGA降解速度较快，PLGA的降解性和拉伸性能与培养条件有很大关系、调节范围更大。就理想的支架选择而言，控制其降解速率，增强其机械性能，细胞相容性良好，对于构建膝关节组织工程韧带均有重要意义。

目前支架材料均处于基础研究阶段，其临床适用性还有待进一步评估[75]。见表2。

表2 构建膝关节组织工程韧带的常见支架材料

4 培养体系与反应条件

构建膝关节组织工程化韧带需要的反应条件，包括对种子细胞和目的细胞的培养方法，如单层共培养、Transwell共培养、三维培养等[76]，使目的细胞所分泌的细胞因子影响并促进种子细胞向目标细胞分化；对支架提供一定的力学刺激，如压缩力、剪切力、流体压力[77]，创造出与机体相似的内环境，促进营养物质与种子细胞充分均匀接触，增进细胞的增殖分化和ECM相关蛋白的合成，在液体流动培养基的影响下让种子细胞与支架材料分布更加匀称。另一方面，相关力学刺激可影响正常体内的韧带生长，体外移植韧带也等同于自然韧带，需要机械信号的一系列刺激。近年研究[78，79]提示通过机械力刺激韧带细胞可改变细胞的黏附活性和细胞骨架的重塑，并且可促进韧带细胞生成更多的Ⅰ、Ⅲ胶原，然而要寻找到膝关节组织工程韧带最适的机械力学刺激，还需对膝关节韧带形成中的力学传导通路机制进行研究。

5 展望

构建膝关节组织工程韧带，需要对种子细胞的筛选、支架材料的分类、生长因子的合理搭配及培养体系与反应条件等多个环节的搭配与重塑。随着生物医学的发展，我们可以选择与机体具有更好生物相容性、机械拉伸性能更佳的组织工程人工韧带，在此过程中需要更深入研究膝关节韧带损伤后的修复与再生机制。而要获得组织工程化韧带与人膝关节韧带功能上的完全一致，尚需生命科学、工程力学、材料科学等多专业学科在不同领域的不断发展和合作。

[1]Ludwig M，Atanda A，Jr.Management of anterior cruciate ligament tears in skeletally immature athletes.Phys Sportsmed，2015，43（4）：440-447.

[2]Weiss K，Whatman C.Biomechanics Associated with Patellofemoral Pain and ACL Injuries in Sports.Sports Med，2015，45（9）：1325-1337.

[3]McLean SG，Beaulieu ML.Complex integrative morphologi⁃cal and mechanical contributions to ACL injury risk.Ex⁃erc Sport Sci Rev，2010，38（4）：192-200.

[4]Yasen SK，Borton ZM，Eyre-Brook AI，et al.Clinical out⁃comes of anatomic，all-inside，anterior cruciate ligament（ACL）reconstruction.Knee，2016.

[5]Kim W，McQueen P，Watson JN，et al.Anterior Cruciate Ligament Reconstruction With Bone-Patellar Tendon-Bone Autograft and a Medial Parapatellar Portal.Arthros⁃copy Tech，2016，5（4）：e827-e831.

[6]Mutsuzaki H，Fujie H，Nakajima H，et al.Effect of Calci⁃um Phosphate-Hybridized Tendon Graft in Anatomic Sin⁃gle-Bundle ACL Reconstruction in Goats.J Sports Med，2016，4（8）：2325967116662653.

[7]Cartmell JS，Dunn MG.Development of cell-seeded patel⁃lar tendon allografts for anterior cruciate ligament recon⁃struction.Tissue Eng Part A，2004，10（7-8）：1065-1075.

[8]Wang Y，Dang Z，Cui W，et al.Mechanical stretch and hypoxia inducible factor-1 alpha affect the vascular endo⁃thelial growth factor and the connective tissue growth fac⁃tor in cultured ACL fibroblasts.Connect Tissue Res，2016，1-7.

[9]Endress R，Woon CY，Farnebo SJ，et al.Tissue-engi⁃neered collateral ligament composite allografts for scaphol⁃unate ligament reconstruction：an experimental study.J Hand Surg Am，2012，37（8）：1529-1537.

[10]Andia I，Maffulli N.Biological Therapies in Regenerative Sports Medicine.J Sports Med，2016.

[11]Battaglia MJ，et al.Medial collateral ligament injuries and subsequent load on the anterior cruciate ligament：a biomechanical evaluation in a cadaveric model.Am J Sports Med，2009，37（2）：305-311.

[12]Brune T，Borel A，Gilbert TW，et al.In vitro comparison of human fibroblasts from intact and ruptured ACL for use in tissue engineering.Eur Cell Mater，2007，14：78-90；discussion-1.

[13]Nguyen DT，Dellbrugge S，Tak PP，et al.Histological char⁃acteristics of ligament healing after bio-enhanced repair of the transected goat ACL.J Exper Ortho，2015，2（1）：4.

[14]Sun L，Qu L，Zhu R，et al.Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchy⁃mal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibro⁃blast.Stem Cells Int，2016，2016：9842075.

[15]方宁，张路，宋秀军，等.人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定.遵义医学院学报，2009，32（3）：234-236

[16]Bilic G，Zeisberger SM，Mallik AS，et al.Comparative characterization of cultured human term amnion epitheli⁃al and mesenchymal stromal cells for application in cell therapy.Cell Transplant，2008，17（8）：955-968.

[17]Ilancheran S，Moodley Y，Manuelpillai U.Human fetal membranes：a source of stem cells for tissue regenera⁃tion and repair?Placenta，2009，30（1）：2-10.

[18]Miki T.A Rational Strategy for the Use of Amniotic Epi⁃thelial Stem Cell Therapy for Liver Diseases.Stem Cells Transl Med，2016，5（4）：405-409.

[19]Choi K，Ortega MT，Jeffery B，et al.Oxidative stress re⁃sponse in canine in vitro liver，kidney and intestinal mod⁃els with seven potential dietary ingredients.Toxicol Lett，2016，241：49-59.

[20]刘毅，张承昊，范青洪，等.TGF-β和bFGF-1对单层共培养BMSCs和韧带成纤维细胞韧带特异性的影响.中国修复重建外科杂志，2014，11：1406-1412.

[21]Lee P，Tran K，Zhou G，et al.Guided differentiation of bone marrow stromal cells on co-cultured cartilage and bone scaffolds.Soft Matter，2015，11（38）：7648-7655.

[22]Fu W，Li Q，Tang X，et al.Mesenchymal stem cells re⁃side in anterior cruciate ligament remnants in situ.Int Orthop，2016，40（7）：1523-1530.

[23]赵孟和，陆泉丞，李洪权，等.组织工程韧带应用于前交叉韧带重建术的研究与进展.中国组织工程研究与临床康复，2007，02：333-335.

[24]Wu T，Liu Y，Wang B，et al.The Use of Co-cultured Mesenchymal Stem Cells with Tendon-derived Stem Cells as a Better Cell Source for Tendon Repair.Tissue Eng Part A，2016，19-20：1229-1240.

[25]Canseco JA，Kojima K，Penvose AR，et al.Effect on liga⁃ment marker expression by direct-contact co-culture of mesenchymal stem cells and anterior cruciate ligament cells.Tissue Eng Part A，2012，18（23-24）：2549-2558.

[26]Yu Y，Zhou Y，Cheng T，et al.Hypoxia enhances teno⁃cyte differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells by inducing hypoxia-inducible factor-1alpha in a co-culture system.Cell Prolif，2016，49（2）：173-184.

[27]Veronesi F，Della Bella E，Torricelli P，et al.Effect of ad⁃ipose-derived mesenchymal stromal cells on tendon heal⁃ing in aging and estrogen deficiency：an in vitro co-cul⁃ture model.Cytotherapy，2015，17（11）：1536-44.

[28]Parolini O，Caruso M.Review：Preclinical studies on pla⁃centa-derived cells and amniotic membrane：an update. Placenta，2011，32 Suppl 2：S186-95.

[29]Chen B，Li B，Qi YJ，et al.Enhancement of tendon-tobone healing after anterior cruciate ligament reconstruc⁃tion using bone marrow-derived mesenchymal stem cells genetically modified with bFGF/BMP2.Sci Rep，2016，6：25940.

[30]Qiao J，An N.Effect of concentrated growth factors on function and Wnt3a expression of human periodontal liga⁃ment cells in vitro.Platelets，2016，1-6.

[31]Bissell L，Tibrewal S，Sahni V，et al.Growth factors and platelet rich plasma in anterior cruciate ligament recon⁃struction.Curr Stem Cell Res Ther，2014，10（1）：19-25.

[32]Oishi S，Shimizu Y，Hosomichi J，et al.Intermittent Hy⁃poxia Influences Alveolar Bone Proper Microstructure via Hypoxia-Inducible Factor and VEGF Expression in Peri⁃odontal Ligaments of Growing Rats.Frontiers in physiolo⁃gy，2016，7：416.

[33]Schmal H，Bernstein A，Feucht MJ，et al.Prospective Clin⁃ical Trial for Septic Arthritis：Cartilage Degradation and Inflammation Are Associated with Upregulation of Carti⁃lage Metabolites.Mediators Inflamm，2016，2016：5491971.

[34]Leong NL，Arshi A，Kabir N，et al.In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate lig⁃ament reconstruction.J Orthop Res，2015，33（2）：229-236.

[35]Zhang C，Li Q，Deng S，et al.bFGF-and CaPP-Loaded Fibrin Clots Enhance the Bioactivity of the Tendon-Bone Interface to Augment Healing.Am J Sports Med，2016，44（8）：1972-1982

[36]Tang JB，Wu YF，Cao Y，et al.Basic FGF or VEGF gene therapy corrects insufficiency in the intrinsic heal⁃ing capacity of tendons.Sci Rep，2016，6：20643.

[37]Ghebes CA，van Lente J，Post JN，et al.High-Throughput Screening Assay Identifies Small Molecules Capable of Modulating the BMP-2 and TGF-beta1 Signaling Path⁃way.J Biomol Screen，2016.

[38]Ripamonti U，Duarte R，Parak R，et al.Redundancy and Molecular Evolution：The Rapid Induction of Bone Forma⁃tion by the Mammalian Transforming Growth Factor-be⁃ta3 Isoform.Frontiers in Physiology，2016，7：396.

[39]Kurebayashi Y，Baba Y，Minowa A，et al.TGF-beta-in⁃duced phosphorylation of Akt and Foxo transcription fac⁃tors negatively regulates induced regulatory T cell differ⁃entiation.Biochem Biophys Res Commun，2016.

[40]Lee SB，Lim AR，Rah DK，et al.Modulation of heat shock protein 90 affects TGF-beta-induced collagen syn⁃thesis in human dermal fibroblast cells.Tissue Cell，2016，48（6）：616-623.

[41]金瑛，李豫皖，张承昊，等.体外诱导人羊膜间充质干细胞向韧带细胞分化的实验研究.中国修复重建外科杂志，2016，02：237-244.

[42]Xie J，Wang C，Huang DY，et al.TGF-beta1 induces the different expressions of lysyl oxidases and matrix metallo⁃proteinases in anterior cruciate ligament and medial col⁃lateral ligament fibroblasts after mechanical injury.J Bio⁃mech，2013，46（5）：890-898.

[43]Takigami J，Hashimoto Y，Yamasaki S，et al.Direct boneto-bone integration between recombinant human bone morphogenetic protein-2-injected tendon graft and tunnel wall in an anterior cruciate ligament reconstruction mod⁃el.Int Orthop，2015，39（7）：1441-1447.

[44]Ruschke K，Meier C，Ullah M，et al.Bone morphogenetic protein 2/SMAD signalling in human ligamentocytes of degenerated and aged anterior cruciate ligaments.Osteoar⁃thritis Research Society，Osteoarthritis Cartilage，2016，24（10）：1816-1825.

[45]Cheng P，Han P，Zhao C，et al.High-purity magnesium interference screws promote fibrocartilaginous entheses re⁃generation in the anterior cruciate ligament reconstruc⁃tion rabbit model via accumulation of BMP-2 and VEGF.Biomaterials，2016，81：14-26.

[46]Kuroda S，Goto N，Suzuki M，et al.Regeneration of bone-and tendon/ligament-like tissues induced by gene transfer of bone morphogenetic protein-12 in a rat bone defect.J Tissue Eng，2010，2010：891049.

[47]Komzak M，Hart R，Smid P，et al.The effect of plateletrich plasma on graft healing in reconstruction of the an⁃terior cruciate ligament of the knee joint：prospective study.Acta Chir Orthop Traumatol Cech，2015，82（2）：135-139.

[48]Woo YK，Kwon SY，Lee HS，et al.Proliferation of anteri⁃or cruciate ligament cells in vitro by photo-immobilized epidermal growth factor.J Orthop Res，2007，25（1）：73-80.

[49]Tashiro T，Hiraoka H，Ikeda Y，et al.Effect of GDF-5 on ligament healing.JOrthop Res，2006，24（1）：71-79.

[50]Herchenhan A，Bayer ML，Eliasson P，et al.Insulin-like growth factor I enhances collagen synthesis in engi⁃neered human tendon tissue.Growth Horm IGF Res：offi⁃cial journal of the Growth Hormone Research Society and the International IGF Research Society，2015，25（1）：13-19.

[51]Farnebo S，Woon CY，Bronstein JA，et al.Decellularized tendon-bone composite grafts for extremity reconstruction：an experimental study.Plast Reconstr Surg，2014，133（1）：79-89.

[52]Youngstrom DW，Barrett JG.Tendon Differentiation on Decellularized Extracellular Matrix Under Cyclic Loading. Methods Mol Biol，2016，1502：195-202.

[53]Cheng CW，Solorio LD，Alsberg E.Decellularized tissue and cell-derived extracellular matrices as scaffolds for or⁃thopaedic tissue engineering.Biotechnol Adv，2014，32（2）：462-484.

[54]Dong S，Huangfu X，Xie G，et al.Decellularized Versus Fresh-Frozen Allografts in Anterior Cruciate Ligament Reconstruction：An In Vitro Study in a Rabbit Model. Am J Sports Med，2015，43（8）：1924-1934.

[55]Chen J，Xu J，Wang A，et al.Scaffolds for tendon and lig⁃ament repair：review of the efficacy of commercial prod⁃ucts.Expert Rev Med Devices，2009，6（1）：61-73.

[56]Grier WK，Iyoha EM，Harley BA.The influence of pore size and stiffness on tenocyte bioactivity and transcriptom⁃ic stability in collagen-GAG scaffolds.J Mech Behav Biomed Mater，2016，65：295-305.

[57]潘娟，刘国明，宁良菊，等.脱细胞肌腱片促进兔肩袖损伤腱-骨愈合的实验研究.中国修复重建外科杂志，2013，09：1070-1075.

[58]Trzeciak T，Richter M，Suchorska W，et al.Application of cell and biomaterial-based tissue engineering methods in the treatment of cartilage，menisci and ligament injuries. Int Orthop，2016，40（3）：615-624.

[59]Teuschl A，Heimel P，Nurnberger S，et al.A Novel Silk Fiber-Based Scaffold for Regeneration of the Anterior Cruciate Ligament：Histological Results From a Study in Sheep.Am J Sports Med，2016，44（6）：1547-1557.

[60]Chen X，Yin Z，Chen JL，et al.Scleraxis-overexpressed human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells for tendon tissue engineering with knitted silk-colla⁃gen scaffold.Tissue Eng Part A，2014，20（11-12）：1583-1592.

[61]Irie T，Majima T，Sawaguchi N，et al.Biomechanical and histologic evaluation of tissue engineered ligaments using chitosan and hyaluronan hybrid polymer fibers：a rabbit medial collateral ligament reconstruction model.J Biomed Mater Res A，2011，97（2）：111-117.

[62]Yang JM，Yang JH，Tsou SC，et al.Cell proliferation on PVA/sodium alginate and PVA/poly（gamma-glutamic ac⁃id）electrospun fiber.Mater Sci Eng C，Materials for bio⁃logical applications，2016，66：170-177.

[63]Sun L，Li H，Qu L，et al.Immobilized lentivirus vector on chondroitin sulfate-hyaluronate acid-silk fibroin hy⁃brid scaffold for tissue-engineered ligament-bone junc⁃tion.BioMed research international，2014，2014：816979.

[64]Wang M，Favi P，Cheng X，et al.Cold atmospheric plas⁃ma（CAP）surface nanomodified 3D printed polylactic ac⁃id（PLA）scaffolds for bone regeneration.Acta Biomater，2016. [65]Khojasteh A，Fahimipour F，Eslaminejad MB，et al. Development of PLGA-coated beta-TCP scaffolds contain⁃ing VEGF for bone tissue engineering.Mater Sci Eng C，2016，69：780-788.

[66]Stolzel K，Schulze-Tanzil G，Olze H，et al.Immortalised human mesenchymal stem cells undergo chondrogenic dif⁃ ferentiation in alginate and PGA/PLLA scaffolds.Cell Tis⁃sue Bank，2015，16（1）：159-70.

[67]Macarini L，Milillo P，Mocci A，et al.Poly-L-lactic acidhydroxyapatite（PLLA-HA）bioabsorbable interference screws for tibial graft fixation in anterior cruciate liga⁃ment（ACL）reconstruction surgery：MR evaluation of os⁃teointegration and degradation features.Radiol Med，2008，113（8）：1185-1197.

[68]Toosi S，Naderi-Meshkin H，Kalalinia F，et al.PGA-incor⁃porated collagen：Toward a biodegradable composite scaf⁃fold for bone-tissue engineering.J Biomed Mater Res A，2016，104（8）：2020-2028.

[69]Deepthi S，Nivedhitha Sundaram M，Deepti Kadavan J，et al.Layered chitosan-collagen hydrogel/aligned PLLA nanofiber construct for flexor tendon regeneration.Carbo⁃hydr Polym，2016，153：492-500.

[70]Pinese C，Leroy A，Nottelet B，et al.Rolled knitted scaf⁃folds based on PLA-pluronic copolymers for anterior cru⁃ciate ligament reinforcement：A step by step conception. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2016.

[71]Kahn CJ，Ziani K，Zhang YM，et al.Mechanical proper⁃ties evolution of a PLGA-PLCL composite scaffold for ligament tissue engineering under static and cyclic trac⁃tion-torsion in vitro culture conditions.J Biomater Sci Polym Ed，2013，24（8）：899-911.

[72]Lubowitz JH.Editorial commentary：ACL bioactive scaf⁃fold.Arthroscopy：J Arthroscopic Related Surg：official publication of the Arthroscopy Association of North Amer⁃ica and the International Arthroscopy Association，2015，31（5）：998.

[73]Sahoo S，Toh SL，Goh JC.A bFGF-releasing silk/PLGA-based biohybrid scaffold for ligament/tendon tissue engi⁃neering using mesenchymal progenitor cells.Biomaterials，2010，31（11）：2990-2998.

[74]Leroy A，Nottelet B，Bony C，et al.PLA-poloxamer/polox⁃amine copolymers for ligament tissue engineering：sound macromolecular design for degradable scaffolds and MSC differentiation.J Biomater Sci Polym Ed，2015，3（4）：617-626.

[75]Bellincampi LD，Closkey RF，Prasad R，et al.Viability of fibroblast-seeded ligament analogs after autogenous im⁃plantation.J Orthop Res：official publication of the Ortho⁃paedic Research Society，1998，16（4）：414-420.

[76]Schwarting T，Pretzsch S，Debus F，et al.The Effect of Cyclooxygenase Inhibition on Tendon-Bone Healing in an In Vitro Coculture Model.Mediators Inflamm，2015，2015：926369.

[77]Bourdon-Santoyo M，Quinones-Uriostegui I，Martinez-Lo⁃pez V，et al.Preliminary study of an in vitro develop⁃ment of new tissue applying mechanical stimulation with a bioreactor as an alternative for ligament reconstruction.Rev Invest Clin，2014，66 Suppl 1：S100-10.

[78]Sun L，Qu L，Zhu R，et al.Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchy⁃mal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibro⁃blast.Stem Cells Int，2016，2016：9842075.

[79]Govoni M，Muscari C，Lovecchio J，et al.Mechanical Actu⁃ation Systems for the Phenotype Commitment of Stem Cell-Based Tendon and Ligament Tissue Substitutes. Stem Cell Rev，2016，12（2）：189-201.

2016.10.17

贵州省科技厅社会发展科技攻关项目（黔社科合SY字[2010]3091）；贵州省科学技术基金资助项目（黔科合LH字[2016] 7477号）

刘毅，Email：13308529536@163.com