QuEChERS-UPLC-HR-MS法测定蔬菜大棚土壤中农药残留

宫小明王洪涛华萌萌王 玲

（1.潍坊出入境检验检疫局 山东潍坊 261041；2.潍坊医学院）

QuEChERS-UPLC-HR-MS法测定蔬菜大棚土壤中农药残留

宫小明1，2王洪涛1华萌萌1王 玲2

（1.潍坊出入境检验检疫局 山东潍坊 261041；2.潍坊医学院）

采用QuEChERS法结合超高效液相色谱-高分辨质谱法建立了蔬菜大棚土壤中百余种常见农药残留的同时分析方法。样品采用乙腈（含体积分数为2%的甲酸）提取，ODS粉净化，经Agilent ZORBAX SB-C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱分离，高分辨质谱进行检测。结果表明：在0.01-1.0mg/L质量浓度范围内，农药仪器响应值与其质量浓度呈良好线性相关，相关系数均大于0.99；添加水平在0.01mg/kg时，平均回收率为68.7%-101.8%，相对标准偏差（RSD）为6.2%-14.1%，定量限均小于0.005mg/kg。该方法具有灵敏度高、简便、快速等优点，能充分满足蔬菜大棚土壤中农药残留的高通量检测要求。

土壤；农药残留；液相色谱-高分辨质谱；QuEChERS

1 前言

现代农业的发展对于农药的依赖程度越来越高[1]，然而农药作为人类合成的高危险化学品，过度使用和滥用对环境和人类健康都会造成极大危害，其残留物会进入土壤、空气、地表水和地下水，甚至进入食物链从而对整个生态系统造成破坏[2]，因此农药残留问题已经成为影响地球环境、人类社会发展亟待解决的难题。解决这一难题的重点在于从技术上了解，并制定相关的法律、法规及政策，而农药残留的检测在技术层面显得尤为重要，并为此花费了大量精力和财力。

对样品进行分析时，由于分析物的化学性质不同、基质复杂、分析浓度较低，必须对样品进行前处理，而土壤成分复杂，用药史不确定性高，所以确定土壤前处理的方法更加重要[3]。QuEChERS技术是2003年由美国化学家Steven J.Lehotay和德国的Michelangelo Anastassiadas提出的一种分散固相萃取样品处理方法，该技术的特点是快速、简单、低成本、高通量，非常适合多残留检测[4-7]。

液相色谱串联四级杆质谱是痕量有机物检测中的常用方法[8-12]，但此方法必须依赖目标化合物的标准物质对仪器方法进行优化，在多残留检测和未知化合物分析中的应用受到限制。轨道阱高分辨质谱仪具有较高的分辨率、扫描速度和灵敏度，可以实现高通量的目标物或非目标物筛选和高可靠性的确证定量分析[13-15]。本研究利用Exactive液相色谱质谱联用系统，借助QuEChERS技术对样品进行前处理，建立了土壤中百余种常见农药残留的同时分析方法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

静电场轨道阱高分辨质谱仪：Exactive，Thermofisher；液相色谱仪：U-3000，Thermo；万分之一天平：AE163，Mettler；均质器：T25，IKA；振荡器：MS1，IKA；离心机：5810R，Eppendorf；氮吹仪：N-EVAP-111，Organomation。

2.1.2 试剂

乙睛、甲醇、甲酸：均为色谱纯，购于美国Fisher公司；水：Milli-Q超纯水，使用前过0.45 μm滤膜；氯化钠、二甲基十八碳硅烷粉（ODS）：均为分析纯，购于Agela Technologies公司；239种农药标准品（表1）：购于德国 Dr．Ehrenstorfer公司、美国 Chemservice公司、德国Fluka公司等。

2.1.3 试验样品

土壤样品采用随机多点取样法在每一基地分别选取5-10个取样点，采集耕层土壤（0-20 cm），混匀，放置于样品袋中。土壤在室温下风干，除去植物残根，过60目筛，于室温避光保存备用。

2.2 方法

2.2.1 农药标准溶液的配制

混合农药标准液：按照农药性质，将其分为有机磷类、有机氯类、有机氮类、氨基甲酸酯类、除草剂类5种，分别量取100mg/L的农药标准液各3mL，依次添加、蒸干后用甲醇定容为30mL，得到10mg/L的混合农药标准储备液，于-18℃避光密封储存（有效期3个月）。

基质混合农药标准液：用土壤空白提取液配制系列浓度基质混合标准液，用于基质标准曲线的测定。

2.2.2 样品前处理

称取10.0g（精确至0.01g）土壤样品，放入50mL离心管中，加入20mL乙腈均质提取1min，10 000 rpm离心10min；取2.5mL上清液至10mL离心管中，加入200mg ODS粉，涡混1min；沉淀后取2mL上清液40℃氮气吹干，加入1mL甲醇0.1%甲酸水（3+7）溶液溶解准备上机检测。

2.2.3 液相色谱质谱条件

2.2.3.1 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0×100 mm，1.8 μm）；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：10 μL；流动相：A-0.1%甲酸水，B-甲醇；梯度洗脱程序：5%B 保持 1.0min，1.0→8.0min由 5%B→98%B，8.0→12.0min 98%B，12.0→12.5min 5%B， 平衡2min。

2.2.3.2 质谱条件

全扫描正离子模式（质量范围100到1 500）；分辨率：50 000；扫描速度：4 Hz；自动增益控制（AGC）目标值：10e6；喷雾电压：2 200 V；离子传输管温度：280°C；鞘气气压：32 au；辅助气压：10 au；离子源温度：200°C。

3 结果与讨论

3.1 MS条件优化

高分辨质谱仪不需要对质谱条件进行特殊优化，可以采用通用质谱条件，只需调整扫描质量范围即可。化合物筛选离子提取误差范围为5 ppm。需要考虑的是部分农药属于小分子物质，受热易分解，因此离子传输管温度和气化室温度在满足传输效率和雾化效果的前提下适当降低，避免化合物受热分解导致响应值较低。

3.2 UPLC条件优化

3.2.1 液相色谱柱的选择

在色谱柱分离速度和灵敏度方面，选用粒径1.8 μm填料的色谱柱。使用标准工作液对色谱柱进样分离得到色谱图，分离效果和灵敏度较好。这是由于柱填料粒径由5 μm缩小到1.8 μm，单位体积内的表面积大大增加，使柱效显著提高。超高效液相色谱柱具有极高的柱效和分离速度，使用0.3-0.4mL/min的柱流速与电喷雾离子化方式所要求的流速具有良好的匹配。

液相色谱串联高分辨质谱检测，保留时间是定性很重要的一个因素。由于是多残留分析，故采用100 mm的长柱，达到将所有化合物进行有效分离，降低基质效应影响的目的。

3.2.2 流动相的选择

液质联用技术应用中，流动相的选择除考虑色谱系统分离效果外，还必须关注分离各组分进质谱前的离子化效率，以获得最佳的分辨率和灵敏度。在对目标物进行质谱全扫描中发现：分别选用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%甲酸水溶液、乙腈/0.1%甲酸水溶液作为流动相，在电喷雾源ESI+方式下，在乙腈/0.1%甲酸水和甲醇/0.1%甲酸水溶液溶液组成的流动相中，离子化效率优于其他试剂。在比较乙腈/0.1%甲酸水和甲醇/0.1%甲酸水两种溶液时发现，由于乙腈极性较高，在离子源部分和水溶液雾化后形成包裹层，导致电离效果差，部分目标物响应值低；甲醇极性较低，不容易形成包裹层，目标物响应值得到提高。因此选择甲醇/0.1%甲酸水作为流动相。

本研究涉及的是百余种农药的筛查与定量，故采用较长的洗脱时间和较为温和的梯度洗脱条件，以期尽量将所有化合物进行有效分离。

3.3 线性范围、定量限、回收率和精密度

用基质提取液配制一系列不同浓度的农药混合标准溶液，依次进样，以峰面积为纵轴，浓度为横轴制作校准曲线，由工作站可直接计算回归方程及相关系数，分析物在2.0-100 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均小于0.99。

用加标方法进行回收率和精密度实验（加标浓度分别为 5、10、20 μg/kg），平行测定 6 次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表1。从表1可以看出，平均回收率均为68.7%-101.8%，相对标准偏差（RSD）均小于11.6%。

表1 农药的分子式、检测离子、平均回收率、相对标准偏差及保留时间

（续表1）

（续表1）

（续表1）

3.4 Orbitrap快速筛查技术流程

数据处理在ExactFinder软件上按照定性和定量工作流程进行，样品都进行目标物和非目标物筛选，以准确的质量数和保留时间做为目标筛选的鉴定标准，鉴定出的分析物通过将给出的元素组成与测定信号的同位素模式进行自动匹配实现验证，所有的信号和元素组成按照预定义的元素列表上的同位素分布计算。最后，在分辨率达到50 000的情况下获得的数据降低了同质量数干扰物共洗脱的可能性，从而减少了假阳性的可能性。

3.5 实际样品检测

随机对某地大棚的7份土壤样品进行检测，7份样品中全部检出啶虫咪、噻嗪酮、精甲霜灵等3种农药，3种农药的高分辨质谱总离子及提取离子流谱见图1，含量见表2。结果显示，上述3种农药的应用比较普遍，并且经过近几年的过度种植，土壤农药残留的问题比较严重。

图1 检出样品的高分辨质谱总离子及提取离子流谱图

表2 7份土壤样品中3种检出农药的含量

4 结论

本研究运用QuEChERS技术进行提取和净化，借助静电场轨道阱高分辨质谱仪分辨率、出色的质量精度、高灵敏度和宽动态范围等特点对样品进行检测，建立土壤中上百种农药残留同时检测的方法。该方法简单、快速、准确、灵敏度高，适合于蔬菜大棚土壤中农药残留的高通量检测。

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Determination of Pesticide Residues in Vegetable Greenhouse Soil by UPLC-HR-MS and QuEChERS

GONG Xiaoming1，2，WANG Hongtao1， HUA Mengmeng1，WANG Ling2
（1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Weifang， Shandong， 261041；2.Weifang Medical University）

A rapid analytical method for simultaneous determination of hundreds of pesticide residues in soil was established based on QuEChERS with ultraperformance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry（UPLC-HR-MS）.The sample was extracted with acetonitrile（containing 2%formic acid）and purified by votexing with ODS.The extractions were separated by a Agilent ZORBAX SB-C18 column（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）before submitting for detection by high-resolution mass spectrometry.The results showed that a good linearity ranged from 0.01-1.0mg/L was obtained and correlation coefficient was higher than 0.99.The average recoveries ranged from 68.7%-101.8%and the relative standard deviations and from 6.2%-14.1%at the concentrations of 0.01mg/kg respectively，the limits of quantification（LOQ）were all below to 0.005mg/kg.The proposed method was accurate，rapid and reliable，which can be successfully applied to the high-throughputanalysisofpesticide residuesin vegetable greenhouse soil.

Soil；Pesticide Residues；Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry；QuEChERS

O657.63；S481.8

E-mail：9647125@qq.com

国家质检总局科技计划项目（2013IK177）

2016-12-19