应用DNA条形码技术鉴别燕窝的基源

刁雅欣刘德星邱德义*刘环宇

（1.中山出入境检验检疫局 广东中山 528403；2.广东药科大学）

应用DNA条形码技术鉴别燕窝的基源

刁雅欣1，2刘德星1邱德义1*刘环宇2

（1.中山出入境检验检疫局 广东中山 528403；2.广东药科大学）

利用DNA条形码技术对燕窝进行基源鉴别。提取燕窝基因组DNA，选择多细胞动物线粒体细胞色素氧化酶I（CO I）的通用引物进行DNA扩增。PCR产物测序分析后，输入GenBank中进行BLAST搜索，分析样品遗传距离、构建NJ系统发育树，同时利用实时荧光PCR法对燕窝中是否掺有猪源性成分进行检测。结果显示，收集的15个样品中，13个样品与爪哇金丝燕Aerodramus fuciphagus的CO I DNA序列相似度高于 99%，其余2个样品无法获取目的PCR产物；实时荧光定量PCR结果显示15个样品的Ct值均大于 35，样品检测含猪源成分呈阴性。因此，DNA条形码技术为判断燕窝的基源提供了一个可行方法。

燕窝；DNA条形码；CO I序列；实时荧光PCR

1 前言

燕窝为金丝燕属（Aerodramus或Collocalia）鸟类用唾液与绒羽等混合凝结而筑成的巢窝[1]，最早记载于《本草备要》和《本经逢原》[2]。商品燕窝主要包括官燕、毛燕和草燕 3类[3]，按形状可以分为燕盏、燕条、燕碎、燕饼、燕角、燕网等[4]，不同品种的燕窝价格和质量差异巨大。燕窝是我国传统的滋补佳品，其主要活性成分是唾液酸，而唾液酸被认为在增强人体免疫力中有着重要作用[5]，另外天然燕窝的采集十分困难和危险[6]，这些因素导致天然燕窝的价格十分高昂。

燕窝的产地包括印度尼西亚、马来西亚、泰国、越南、菲律宾和中国，主要集中在东南亚。其中印度尼西亚占全球总产量的80%，马来西亚13%，泰国约5%，并且不同产地的燕窝也有较大差异。截止2016年，国家质检总局进出口食品安全局公布的允许进口食用燕窝注册企业仅有马来西亚16家、印度尼西亚6家。但国内市场不乏通过其他非法渠道入境或通过个别旅客携带物入境燕窝，在逃避检验检疫的同时，也带来了较大的潜在食品安全和生物安全风险。

在利益驱使下，国内外一些不法分子对燕窝掺假或造假的行为日益严重，并且造假水平越来越高。假燕窝不仅扰乱了燕窝的市场秩序，还会对消费者的利益和身体健康造成危害。2015年10月27日，国家质检总局进出口食品安全局发布了关于对进口含燕窝成分食品监管要求的警示通报。因此，如何快速、准确鉴别燕窝的真假，以及鉴别掺假燕窝中成分等问题亟需解决。燕窝的掺假手段包括染色、漂白、掺涂胶体、掺粘廉价燕窝等，常见的燕窝掺假物有银耳、琼脂、猪皮及蛋清等[6]。其中猪皮由于廉价且少量掺于燕窝中后肉眼难以辨别等特点，被作为燕窝的最常见掺假物。

随着燕窝商品来源日益复杂，仅凭外观特征和显微鉴别已经很难达到鉴别目的。目前已有检测机构以亚硝酸盐、唾液酸含量等理化指标用于燕窝质量鉴别，但理化检验尚存在局限性较大、专属性不强等弱点，尤其是无法区别燕窝的基源、产地、等级等质量问题[7]，普通的检测方法还很难检测出燕窝中的微量掺假物。分子生物学技术不仅快速、简便、高通量，而且可以从界至种水平上系统鉴定生物种类，目前已广泛应用于出入境检验领域[8]。DNA条形码技术（DNA Barcoding）为近年来国际上兴起的一种新的物种鉴定方式，可从基因水平上对样品的种类进行鉴别。目前，国内外学者已经将DNA条形码技术应用于生物物种、加工食品、真菌以及中药材的鉴定[9-14]等广大领域，但在燕窝中，利用最多的是Cytb和ND2基因，而不是动物DNA条形码通用基因-线粒体CO I基因，例如王凤云[3]利用Cytb基因对32个商品燕窝样品进行检测，有23个官燕窝基源为爪哇金丝燕A.fuciphagus，8个官燕窝为爪哇金丝燕的淡腰金丝燕亚种A.fuciphagus germani，1个毛燕窝的基源为大金丝燕A.maximus或其亚种A.maximus lowi。王凤云[15]利用ND2基因对燕窝样品的基源进行鉴别。林洁茹[16]利用Cytb基因对来自印度尼西亚的13个燕窝样品进行研究，结果发现其来源均为爪哇金丝燕。

本研究尝试将动物DNA条形码通用基因-线粒体CO I基因片段作为分子标记，利用DNA条形码技术对收集的燕窝进行真假鉴定以及基源鉴别，检验CO I基因是否适用于雨燕科鸟类的物种鉴定；进一步利用实时荧光定量PCR对燕窝中是否掺有猪源性成分进行检测。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品来源

本研究以14个不同来源的商品燕窝和1个口岸截获燕窝为材料。其中，14个商品燕窝的样品采购自广东省中山市药店、市场等，包括1个毛燕和13个官燕，产地均为商家自报或者来自商品标识。详细信息见表1。

表1 样品信息

2.1.2 主要试剂

PCR扩增所用引物：为多细胞动物线粒体细胞色素氧化酶 I（CO I）的通用引物 LCO1490（5’-GGT CAACAAATCATAAAGATATTGG-3’）和 HCO2198（5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’）[17，18]，由大连宝生物工程有限公司合成；DNA提取试剂盒（目录号D P304）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（目录号D P210）、PCR扩增所需试剂：均购于天根生化科技（北京）有限公司；Taq DNA聚合酶：购于大连宝生物工程有限公司；猪源成分核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）：购于广州双螺旋基因技术有限公司；DNA 裂解液（700mmol/L GuSCN、30mmol/L EDTA pH8.0、30mmol/L Tris-HCl pH 8.0、0.5%Triton X-100、5%Tween-20）：购于美国Amresco 公司。

2.2 方法

2.2.1 总DNA提取

2.2.1.1 燕窝DNA提取

称取燕窝样品50mg于1.5mL离心管中，加入无水乙醇清洗样品以除去燕窝表面携带的细菌和其他可能的污染，用已灭菌的超纯水1mL清洗样品3次以除去样品中残留的无水乙醇。按照DNA提取试剂盒说明书操作步骤提取总DNA，置于-20℃保存备用。

2.2.1.2 燕窝中羽毛的DNA提取

挑选并称取燕窝中的羽毛50mg，于1.5mL离心管中，加入无菌水浸泡，清除残留的燕窝，加入无水乙醇清洗样品以除去羽毛表面携带的细菌和其他可能的污染，用已灭菌的超纯水1mL清洗样品3次以除去样品中残留的无水乙醇，加入DNA裂解液200 μL和蛋白酶K 20 μL于 56℃裂解过夜。裂解完成后按照DNA提取试剂盒说明书裂解后的操作步骤提取总DNA，置于-20℃保存备用。

2.2.2 PCR扩增及测序

PCR 反应体系为 50 μL：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，Taq 酶 0.5μL，正反引物（10μmol/L）各 1 μL，模板 DNA（30 ng/μL）3 μL，加 ddH2O 补足体积。PCR扩增反应条件为：94℃变性 3min；94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 个循环；72℃延伸10min。采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照试剂盒说明书对PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物进行双向测序，测序引物同扩增引物，由上海立菲科技有限公司完成。

2.2.3 实时荧光定量PCR

按试剂盒说明书配制反应 25 μL体系（在冰盒上进行）：A-Sus-P（混合反应液）20 μL，待测燕窝模板5 μL。每次反应均要配制NG-Sus-P（阴性对照）和PG-Sus-P（阳性对照）。反应程序如下：95℃ 10min；95℃ 15 s，60℃ 1min，40 个循环。反应结束后确认扩增曲线并分析结果。

2.2.4 序列分析

利用MEGA 6.0软件对测序所得样品的序列进行拼接，去除引物，得到全长有效序列为 658 bp。通过查看序列的原始峰图检查序列及登陆网址：www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/，将拼接好的序列进行氨基酸翻译，进一步校对序列的质量。将所得序列输入GenBank中进行Blast搜索，对燕窝进行物种鉴定。利用软件MEGA 6.0计算燕窝样品的Jukes-Cantor model遗传距离，选择也可以产出燕窝的雨燕科雨燕属的白腰雨燕Apus pacificus[19]作为外群，用ClustalW分析燕窝样品和其他相近序列并构建NJ系统发育树。

3 结果

3.1 序列分析

收集的14个商品燕窝样品和 1个口岸截获的燕窝样品中，13个样品得到目的DNA序列片段，样品YF燕丝和YG燕碎经多次核酸提取尝试，获得的DNA浓度均小于 5 ng/μL，260/280核酸纯度均小于1.0，无法获得足够的DNA模板。将13个商品燕窝样品的CO I序列上传至GenBank，基因序列号见表2，并在GenBank中进行BLAST搜索，结果显示，商品燕窝样品中相似性最高的序列均为雨燕科金丝燕属的爪哇金丝燕，与其最相似序列的相似度均高于99%，Evalue值均为0，确认13个商品燕窝样品来源于爪哇金丝燕。口岸截获燕窝的羽毛与燕窝样品检测结果经上述分析，确认两者来源均为爪哇金丝燕。

表2 分析样品的基源物种的GenBank序列号

3.2 燕窝样品基于CO I基因的Jukes-Cantor model遗传距离

利用MEGA6.0软件，将13个样品序列计算Jukes-Cantor model遗传距离，见表3。所有样品之间的遗传距离在0.000-0.008之间，根据DNA条形码的物种鉴定规则[18]，可认为13个样品均来源于同一基源。

表3 基于CO I基因的Jukes-Cantor model遗传距离

（续表3）

3.3 燕窝样品与相近物种的NJ系统发育树

下载GenBank中金丝燕属所有物种的6条CO I序列，选取也能产出燕窝的雨燕科雨燕属的白腰雨燕Apus pacificus作为外群，详见表4。下载的序列和所测得13个样品共21个序列用于构建NJ系统发育树，见图1。13个样品的基源均为爪哇金丝燕，支持率为99%。

表4 从GenBank中下载用于构建发育树的序列

图1 基于CO I序列的NJ系统发育树（Kimura 2-parameter model）

3.4 燕窝样品中猪源性成分核酸检测

对15个样品进行实时荧光PCR扩增，结果均为阴性，详见图2。试剂盒对猪源性成分的检出限为0.1%，按照说明书要求设定基线和阈值线。结果显示，所有样品Ct值均大于35，样品呈阴性，即所有样品不含猪源性成分或含量低于检测限。

图2 实时荧光定量PCR扩增曲线图

4 讨论

本研究一共收集了4个产地，5种形状共15种燕窝产品，利用DNA条形码技术对燕窝样品进行检测，结果显示：14个商品燕窝样品和1个截获的样品中中有13个样品基源为爪哇金丝燕，有2个燕窝样品（YF、YG）多次提取后仍未获得目的DNA片段，此2个样品是和其他13个样品使用同样的试剂、同一个人、同批同时处理，因此可以排除试剂或者操作造成的模板DNA提取失败的人为原因；口岸截获燕窝样品中羽毛与样品基源为爪哇金丝燕。对15个燕窝样品中猪源性成分进行核酸检测的结果表明样品均不含猪源性成分。本研究结果与前人的研究基本吻合，且同一燕窝样品中的羽毛鉴定结果与燕盏鉴定结果完全一致，进一步证实了利用DNA条形码技术鉴定燕窝真假、鉴别燕窝基源的可行性。与前人研究相比，本研究选择动物物种通用的DNA条形码基因-CO I基因，此序列保守性适中，非常适合物种的鉴定[18]，且获得技术简单，更适合快速鉴定燕窝基源及真伪鉴别。

在GenBank中查找金丝燕属物种基因组序列时发现共有700余条金丝燕属物种的基因，但其中CO I序列仅有8条，其余序列大多为Cytb和ND2序列。后续研究将继续扩充燕窝样本量，进一步探索产地不同、基源相同的商品燕窝在基因上的差异，以此来解决市场上燕窝标示产地与实际产地不符等问题，为消费者的权益提供保障。同时提醒，国家质检总局对食用燕窝的进口执行境外企业备案制度，目前仅16家马来西亚企业和6家印度尼西亚企业获准生产与出口食用燕窝到中国大陆，其他非法渠道及旅客携带入境者存在较大的食品安全与生物安全风险。

燕丝、燕饼等燕窝制品由于形态破坏，通过常规手段较难准确检验，DNA条形码技术能够在分子水平上对燕窝进行真伪鉴定以及基源的快速检测，不受样品形态影响；DNA条形码技术分类简便且高效，对鉴定人员的知识背景及经验要求较低，为运用于实际的鉴定和检验工作提供了可能性。

5 结论

DNA条形码技术分类简便且高效，为判断燕窝的基源提供了一个可行的方法。

[1]Tukiran N A，IsmailA，Mustafa S，etal.Determination of porcine gelatin in edible bird's nest by competitive indirect ELISA based on anti-peptide polyclonal antibody[J].Food Control，2016，（59）：561-566.

[2]赵冉，李耿，吴依挪，等.燕窝功效研究进展[C].第六次临床中药学学术年会暨临床中药学学科建设经验交流会论文集，1994-2015，525-529.

[3]王凤云，韩亮，赖小平.32种不同产地与品种商品燕窝的DNA基源鉴定 [J].世界科学技术—中医药现代化，2015，17（9）：1876-1882.

[4]简叶叶，李庆旺，黄知几，等.燕窝的营养功效与真伪鉴别研究进展[J].亚热带农业研究，2016，12（2）：136-144.

[5]张嘉宁，汪淑晶.唾液酸生物学与人类健康和疾病[J].生命科学，2011，23（7）：678-684.

[6]Guo L，Wu Y，Liu M，et al.Authentication of Edible Bird's nests by TaqMan-based real-time PCR [J].Food Control，2014，44（44）：220-226.

[7]乌日罕，陈颖，吴亚君，等.燕窝真伪鉴别方法及国内外研究进展[J].检验检疫科学，2007，17（4）：60-62.

[8]乌日罕，陈颖，吴亚君，等.燕窝DNA提取方法比较[J].食品与发酵工程，2008，34（3）：33-36.

[9]陈健，岳巧云，邱德义.DNA条形码技术检测调理肉制品掺杂[J].肉类研究，2016，30（5）：35-39.

[10]岳巧云，邱德义，黄艺文，等.应用DNA条形码技术鉴定未知双翅目蛹[J].中国国境卫生检疫杂志，2011，34（5）：343-347.

[11]邱德义，胡佳，刘德星，等.DNA条形码技术在肉品防欺诈鉴别中的应用[J].肉类研究，2013，27（4）：40-43.

[12]周均亮 赵瑞琳.真菌DNA条形码技术研究进展 [J].微生物学通报，2013，40（8）：1468-1477.

[13]辛天怡，雷美艳，宋经元.中药材DNA条形码鉴定研究进展[J].中国现代中药，2015，17（2）：170-184.

[14]Cho S Y，Suh K I，Bae Y J.DNA barcode library and its efficacy for identifying food-associated insect pests in Korea[J].Entomological Research，2013，43（5）：253-261.

[15]王凤云，蒋颖诗，赖小平.基于ND2基因序列的燕窝DNA条形码鉴别[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（13）：36-40.

[16]林洁茹，周华，赖小平，等[l21].燕窝DNA提取方法研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2010，12（2）：202-2010.

[17]Folmer O，Black M，Hoeh W，et al.DNA Primers for amplification of Mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Molecular Marine Biology&Biotechnology，1994，3（5）：294-299.

[18]Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the Royal Society of B Biological Sciences，2003a，270（1512）：313-321.

[19]林洁茹，周华，赖小平.燕窝研究概述[J].中药材，2006，29（1）：85-89.

Application of DNA Barcoding Technique to the Identification of the Original Species of Cubilose

DIAO Yaxin1，2， LIU Dexing1， QIU Deyi1*， LIU Huanyu2
（1.Zhongshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhongshan， Guangdong，528403；2.Guangdong Pharmaceutical University）

To identify the original species of cubilose by DNA Barcoding technique，Genomic DNA was extracted from cubilose and PCR was performed with the metazoan Mitochondrial Cytochrome Oxidase I（CO I）degenerate primers.The amplified sequence was aligned in the GenBank database，the nearest distances were calculated and a NJ-tree was built as well.Real-time PCR was applied to detect whether swine-originated ingredient was mixed in the cubilose or not.The results showed that 13 out of the 15 collected samples，CO I DNA sequence similarities to Aerodramus fuciphagus were higher than 99%，and the target PCR products could not be obtained from the other 2 samples.Results of the Real-time PCR showed that Ct values of the 15 samples were all over 35，swine-originated ingredient was not detected.DNA barcoding is a potential technical tool to identify the original species of the edible cubilose.

Cubilose；DNA Barcoding；CO I Sequence；Real-Time PCR

Q789

E-mail：m17727517027@163.com；*通讯作者E-mail：qiudy@zs.gdciq.gov.cn

中山市科技计划项目（2014A2FC249）

2016-12-27