Caveolin-1在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

韩燕燕 朱俊宝 李淑华

Caveolin-1在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

韩燕燕 朱俊宝 李淑华

作者单位：371421德州山东省德州市陵城区中医院妇产科

目的探讨窖蛋白-1（Caveolin-1）在子宫内膜癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化法及蛋白质印迹法检测45例子宫内膜癌组织（内膜癌组）、35例子宫内膜良性病变组织（良性组）和35例正常子宫内膜组织（正常组）中Caveolin-1蛋白的表达。实时荧光定量PCR法检测内膜癌组中Caveolin-1mRNA的表达，并分析其与临床病理特征的关系。结果Caveolin-1蛋白在内膜癌组、良性组、正常组中的表达呈递减趋势，差异有统计学意义（P<0.05）；在内膜癌组淋巴结转移者Caveolin-1mRNA表达高于无淋巴结转移者（P=0.001）；TNM分期Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期者高于Ⅰ期者（P=0.002，P=0.040）；低分化、中分化者显著高于高分化者（P＜0.001，P=0.020）；Caveolin-1在子宫内膜癌组织中的表达与年龄及组织分型无明显相关性（P＞0.05）。结论Caveolin-1在子宫内膜癌组织中高表达，且与淋巴结转移、分化程度和TNM分期有关，有望成为子宫内膜癌早期诊断的指标及治疗靶点。

子宫肿瘤；子宫内膜癌；Caveolin-1；免疫组化

窖蛋白-1（Caveolin-1）是重要的支架蛋白，在细胞的内吞作用、胆固醇转运、分子信号转导以及细胞周期、细胞迁移和侵袭方面发挥重要作用［1-2］。Caveolin-1基因起始作为抑癌基因受到重视［3］，但近来研究显示，Caveolin-1基因高表达与肿瘤分级、分期、转移及预后密切相关［4］。本研究检测子宫内膜癌组织中Caveolin-1的表达并分析其与临床病理特征的关系，以探讨其在子宫内膜癌发生发展中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源选择2013年10月至2015年7月山东省德州市陵城区中医院收治的子宫内膜癌患者45例（内膜癌组），年龄35～74岁，平均年龄（53.24± 6.52）岁，所有患者术前均未接受激素治疗及放化疗；同时收集子宫内膜不典型增生35例（良性组），年龄36～73岁，平均年龄（51.38±5.74）岁；子宫内膜正常者35例（正常组，因子宫肌瘤行全子宫切除患者），年龄42～71岁，平均年龄（51.17±5.48）岁。3组年龄比较差异无统计学意义（F＝1.487，P＝0.230）；所有标本均经组织病理学证实，并经患者及家属同意，签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂浓缩型兔抗人Caveolin-1多克隆抗体购自SantaCruz公司；兔抗人多克隆β-actin抗体购自北京中杉金桥生物科技有限公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、T rizol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）购自Fermentas公司；实时荧光定量PCR用SYBR-Premix Ex TaqTMII，购自Takara公司；SP免疫组化染色试剂盒、DAB液底物显色试剂盒购自上海力康生物医疗有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化法检测Caveolin-1蛋白表达水平

4%中性甲醛溶液固定组织标本，石蜡包埋，切片后脱蜡，脱苯，水化。按照SP法试剂盒说明书步骤进行染色，以PBS代替一抗作为阴性对照，食管鳞癌切片作为阳性对照。结果判定：Caveolin-1为膜质表达蛋白，染色阳性为细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒。采用彩色图像分析软件（Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics公司）对染色结果进行分析，校正图片光密度，于HIS颜色模式下选中着色阳性区域，将背景干扰过滤后对每个视野的累计光密度（integral optical denisity，IOD）值进行测定。于每张切片随机选取5个高倍镜视野（×400），进行阳性区域IOD值测定，5个视野下IOD值的平均值定为该例的最终测定值。

1.2.2 蛋白质印迹法检测Caveolin-1蛋白表达水平取等量收集的新鲜组织（50 mg），以RIPR缓冲液蛋白裂解液裂解组织，粉碎匀浆，4℃静置24 h，低温高速离心。取上清液为总蛋白。Bradford法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。取下凝胶在40 V转印2 h封闭后，一抗（Caveolin-1，1∶400；β-action，1∶400）4℃孵育过夜，二抗（1∶50）室温下孵育1 h，TBS洗涤，DAB显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测Caveolin-1 mRNA的表达水平按照Trizol说明书提取细胞总RNA，紫外可见分光光度计测定RNA浓度，依据RNA A260nm/ A280nm≥1.8鉴定RNA纯度，－80℃冻存备用。人Caveolin-1和β-actin引物序列应用Primer Premier 5.0软件（Premier Biosoft International，CA）设计，均由Invitrogen公司合成。Caveolin-1引物序列：上游引物为5′-GACTTTGAAGATGTGATTGC-3′，下游引物为5′-AGATGGAATAGACGCTG-3′，扩增产物为254 bp；内参β-actin引物序列：上游引物为5′-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3′，下游引物为5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′，扩增产物为324 bp［3］。反转录体系20μL，包含样品RNA 2μL，依照Invitrogen公司反转录试剂盒说明书进行操作，获取cDNA。将20μL体系（cDNA 2μL、SYBR Green 9μL、上下游引物各0.2μL、无菌水8.6μL）加入96孔板进行Real-time PCR检测。反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15 s，60℃延伸60 s，30个循环，72℃延伸10 min。每个实验均重复3次，采用2－△△Ct（Ct为循环阈值）方法进行相对定量分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件对数据进行处理。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析不同组织中Caveolin-1的表达差异；χ2检验分析Caveolin-1与子宫内膜癌临床病理特征的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同子宫内膜组织中Caveolin-1蛋白的表达情况

免疫组化法检测结果显示，内膜癌组Caveolin-1蛋白表达为3.12±0.53，高于良性组的1.14±0.41，而后者较正常组的0.93±0.17显著增高（P＜0.05），见图1。蛋白质印迹法检测结果显示，内膜癌组Caveolin-1蛋白表达为0.638±0.024，较良性组的0.497±0.018显著增高，而良性组较正常组（0.316±0.014）显著增高（P＜0.05），见图2。

图1 不同子宫内膜组织中Caveolin-1蛋白的表达（免疫组化法，×400）

图2 不同子宫内膜组织中Caveolin-1蛋白的表达

2.2 Caveolin-1 mRNA表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系

实时荧光定量PCR法检测结果显示，Caveolin-1 mRNA在内膜癌组中的表达与患者年龄（P＝0.052）、组织学分型（P＝0.280）无关。在内膜癌组，有淋巴结转移者Caveolin-1 mRNA表达显著高于无淋巴结转移者（P＝0.001）。TNM分期中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期者Caveolin-1mRNA表达差异有统计学意义（P＝0.009），进一步两两比较，结果显示，Ⅲ+Ⅳ者与Ⅱ期者比较差异无统计学意义（P＝0.198），但显著高于Ⅰ期者（P＝0.002），Ⅱ期者明显高于Ⅰ期者（P＝0.040）；低分化、中分化、高分化者Caveolin-1mRNA的表达差异亦有统计学意义（P＜0.001），进一步两两比较，结果显示，低分化者与中分化者比较差异无统计学意义（P＝0.100），但显著高于高分化者（P＜0.001），中分化者显著高于高分化者（P＝0.020）。见表1。

3 讨论

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见［5］，为绝经后妇女常见的恶性肿瘤，发病率不断上升，且有年轻化趋势［6］。目前对子宫内膜癌的发病机制进行了深入研究，但对其发生、发展的分子机制尚未完全明确。

表1 Caveolin-1mRNA表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系（±s）

表1 Caveolin-1mRNA表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系（±s）

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Caveolin为电子显微镜下可辨识的50～100 nm的质膜凹陷，形态学上表现为囊泡。该蛋白家族由Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3 3个亚型组成。其中Caveolin-1主要定位于多数哺乳类动物的终末分化细胞中［4］，能直接与受体、激酶、黏附分子及G蛋白等信号分子交互作用［7］。推测Caveolin-1可能通过调节肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、黏附和迁移起调控肿瘤的作用［8］。

本研究分别采用免疫组化法及蛋白质印迹法对子宫内膜癌组织中Caveolin-1蛋白的表达水平进行检测，结果显示其在内膜癌组中的表达水平显著高于良性组及正常组，该结果与Caveolin-1在肺鳞状细胞癌［9］、前列腺癌［10］、肾癌［11］、结直肠癌［12］、肺癌［13-14］中的表达一致，符合Caveolin-1基因作为癌基因的条件之一［15-16］。进一步采用实时荧光定量PCR法分析45例子宫内膜癌组织中Caveolin-1 mRNA的表达与临床病理特征的关系，结果发现：⑴中、晚期（Ⅲ+Ⅳ期）子宫内膜癌组织中Caveolin-1 mRNA的表达显著高于早期（Ⅰ期），但中、晚期比较差异无统计学意义，提示Caveolin-1 mRNA可能与子宫内膜癌的早期发生有关；⑵低分化子宫内膜癌组织中Caveolin-1 mRNA的表达显著高于中、高分化组织，而中、低分化组织比较差异无统计学意义，提示Caveolin-1 mRNA与子宫内膜癌早期发生相关；⑶有淋巴结转移的子宫内膜癌组织中Caveolin-1 mRNA的表达高于无淋巴结转移者，提示Caveolin-1 mRNA与子宫内膜癌细胞侵袭和转移相关。

综上所述，本研究结果提示Caveolin-1可促进子宫内膜癌的发生和发展，有望为子宫内膜癌早期诊断提供依据。

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［2016-12-31收稿］［2017-02-25修回］［编辑江德吉］

Clinical significance of Caveolin-1 expression in endometrial carcinoma

Han Yanyan，Zhu Junbao，Li Shuhua（Department of Gynaecology and Obstetrics，Dezhou Lingcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Dezhou 371421 P.R.China）

Objective Toevaluate theexpression ofCaveolin-1 in endometrialcarcinomaand investigate itsassociationwith pathological features.M ethods Caveolin-1 expression was determined by immunohistochemistry and Western blot using rabbit polyclonal antibody in 45 cases of endometrial carcinoma，35 cases of hyperplastic endometrium，and 35 cases of normal endometrium.Caveolin-1 mRNA levels in endometrial carcinoma tissue were determined using real-time PCR.Results Immunohistochemistry and Western blot showed different rates of positive expression of Caveolin-1 in the different types of endometrium.Caveolin-1 expression tended to increase with degree ofmalignancy（P<0.05）.Among cases with endometrial carcinoma，Caveolin-1 expression wasmuch higher in patients with lymph nodemetastasis（P=0.001），and it was higher in stagesⅡandⅢ+Ⅳthan in stage（P=0.002，P=0.040）. Caveolin-1 expression wasmuch higher in moderate and low-grade endometrial carcinoma than in high-grade endometrial carcinoma（P＜0.001，P=0.020）.Conclusions Caveolin-1 expression is higher in endometrial carcinoma than in hyperplastic or normal endometrium，and it correlates significantly with tumor stage and lymph node metastasis.Caveolin-1 may play an important role in endometrial carcinoma progression.

Uterine neoplasms；Endometrial carcinoma；Caveolin-1；Immunohistochemistry

R737.33

A

1674-5671（2017）03-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.08