三阴性乳腺癌患者外周血及肿瘤组织中CD4+ T淋巴细胞上Tim-3和PD-1的表达及其临床意义

徐本玲 袁鹏 陈广玉 王振雷 袁龙

(郑州大学附属肿瘤医院 河南 郑州 450008)

三阴性乳腺癌患者外周血及肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞上Tim-3和PD-1的表达及其临床意义

徐本玲 袁鹏 陈广玉 王振雷 袁龙

(郑州大学附属肿瘤医院 河南 郑州 450008)

目的 探讨三阴性乳腺癌(BC)患者外周血、肿瘤组织和癌旁组织中CD4+T淋巴细胞上Tim-3和PD-1的表达与BC疾病进展的关系。方法 收集郑州大学附属肿瘤医院乳腺外科2013年1月至2014年1月收治的52例BC患者全血标本，并同时收集其中7例Ⅲ期患者的肿瘤组织和癌旁组织标本，采用密度梯度离心法分离获得组织中的淋巴细胞，采用流式细胞学方法检测CD4+T淋巴细胞上Tim-3和PD-1的表达水平。结果 52例BC患者外周血CD4+T淋巴细胞上Tim-3、PD-1和Tim-3+PD-1+的表达水平明显高于其在22例健康人外周血中的表达水平(Tim-3∶2.74%比1.7%，P=0.026 4；PD-1∶17.15%比11.8%，P=0.000 6；Tim-3+PD-1+∶2.23%比1.13%，P=0.006 6)。Ⅲ/Ⅳ期BC患者外周血CD4+T细胞上Tim-3+PD-1+的表达水平明显高于Ⅰ/Ⅱ期BC患者(3.23%比1.66%，P=0.021 6)及健康人。BC患者肿瘤组织中CD4+细胞表面Tim-3，PD-1和Tim-3+PD-1+的表达水平高于癌旁组织和外周血。结论 BC患者外周血及肿瘤组织中CD4+T细胞上抑制性受体Tim-3和PD-1的表达水平升高，可能是CD4+T细胞参与肿瘤细胞免疫逃逸，促进BC病情进展的机制之一。

乳腺癌；CD4+T淋巴细胞；T细胞耗竭；T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子3；程序性死亡分子1

乳腺癌(breast cancer，BC)是全球范围内严重危害女性身体健康的恶性肿瘤[1]，尤其是三阴性BC，因其雌激素受体、孕激素受体及HER-2受体均为阴性，对化疗及内分泌治疗效果均很差，亟需寻找新的治疗策略以提高患者的预后[2]。BC患者的预后不仅取决于肿瘤本身的特点，更重要的是还取决于机体与肿瘤的相互作用。越来越多的研究发现，免疫系统尤其是T细胞在清除或控制肿瘤形成中发挥重要作用，T细胞同时表达多个抑制性受体与耗竭的程度有关。近年来，CD4+T细胞作为机体细胞免疫功能的重要构成部分之一，其在肿瘤免疫治疗中的作用逐渐引起人们的重视。T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim-3) 和程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)是T细胞表面重要的共抑制分子，介导负性调节信号[3-4]。在一项关于免疫检查点的研究中，Tim-3在肿瘤诱导的免疫抑制过程中发挥重要作用，在荷瘤动物模型中，Tim-3+CD8+T细胞亚群显示更强的被抑制特性，并且出现功能障碍。封闭Tim-3则可以获得和封闭PD-1相似的抗肿瘤效应[5]。CD4+T细胞表面Tim-3的表达在BC患者外周血、肿瘤组织及癌旁组织中有何变化，这些变化与BC的临床病理资料有何关系，尚未见报道。鉴于上述原因，本研究通过流式细胞学检测BC患者外周血及肿瘤组织、癌旁组织中CD4+T细胞上Tim-3及PD-1的表达情况并分析其临床意义，旨在探讨CD4+T细胞上免疫抑制性受体与BC发生和发展的关系，从而为三阴性BC的临床治疗提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选取2013年1月至2014年1月入住郑州大学附属肿瘤医院乳腺外科的三阴性BC患者，连续入选。所有患者均为初诊，术前未接受过放化疗及其他治疗。患者的年龄、性别、组织学分级、临床分期等临床资料均被采集。所有患者均由同一位外科医生进行手术。本研究经郑州大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准实施，标本采集均征得患者本人同意并签署知情同意书。

1.2 标本采集 于手术前1 d分别收集三阴性BC患者的清晨空腹外周血标本两管，一管用EDTA-Na2抗凝管采集，另一管用促凝管采集。并于标本收集后2 h内送到郑州大学附属肿瘤医院生物免疫治疗实验室备用。采用相同方法抽取22例健康供者的外周血2 ml作为健康对照组。

组织标本的收集：患者签署知情同意书后，于术中将切下的肿瘤组织及相对应的癌旁组织放到事先准备好的含有庆大霉素(900 IU/ml)，青霉素(500 IU/ml)和链霉素(500 μg/ml)的GTT-551无血清培养基中，立即送往实验室进行下一步的实验检测。

1.3 肿瘤组织及癌旁组织中单细胞悬液的分离 分别将肿瘤组织和癌旁组织剪切成1～2 mm3的组织碎块，分别放入配好的胰蛋白酶混合液中(含胶原酶Ⅰ1 μg/ml，胶原酶Ⅳ1 μg/ml，DNase 25 μg/ml，含2%的胎牛血清)，然后将细胞放入自动旋转仪上，置于37 ℃培养箱中，每30 min观察1次，根据组织消化情况终止反应(加入胎牛血清，其终浓度为5%)。采用Percoll组织样本分离液，密度梯度离心分离获得单细胞悬液备用。

1.4 实验方法 流式细胞学方法检测Tim-3和PD-1在CD4+T细胞上的表达：取外周抗凝血，肿瘤组织及癌旁组织单细胞悬液各100 μl，分别吸取荧光标记的特异性抗体(抗PD-1-FITC，抗CD4-PerCP-cy5.5，抗Tim-3-PE)各5 μl 加入流式管，混合均匀，置于冰上避光孵育 20 min。同时设各通道同型对照管以调补偿。反应后的外周血流式管内加入红细胞裂解液1 ml，振荡混匀，避光放置于37 ℃恒温箱中反应30 min，肿瘤组织及癌旁组织单细胞悬液管省去此步骤。取FACS缓冲液(含5%牛血清白蛋白和0.09%叠氮钠的磷酸盐缓冲液)2 ml，离心，弃上清，用300 μl的FACS缓冲液重悬后，采用FACS AriaⅡ流式细胞仪(BD Pharmingen)进行数据采集，应用FlowJo软件进行数据分析，记录阳性细胞比例。

1.5 统计学分析 应用GraphPad 5.0软件进行统计分析。连续变量数据用中位数和范围描述，外周血中Tim-3的表达与临床病理参数的相关性用Mann-Whitney U test分析；有序变量之间的联系用Spearman相关分析，相关系数用来确定变量因子之间相关的强度。定量资料采用平均数进行描述。肿瘤组织、癌旁组织及外周血中PD-1和Tim-3表达的差异采用成对t检验分析。所有检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入选患者的基本临床特征 符合入选条件的患者共52例，入选患者的中位年龄为61岁(35～77岁)，22个年龄、性别与此相匹配的健康人的标本作为对照。入选研究对象的具体信息见表1。

表1 入选研究对象的临床基本资料(n)

2.2 三阴性BC患者与健康人外周血中CD4+T淋巴细胞上Tim-3和PD-1表达水平的比较 三阴性BC患者外周血中CD4+T淋巴细胞上Tim-3的表达水平为2.74%(0.83%～27.6%)，PD-1的表达水平为17.15%(4.1%～45.7%)，分别高于其在健康对照组外周血中的水平1.7%(0.52%～5.35%)，P=0.026 4(2.74%比1.7%，Tim-3)，11.8%(2.2%～16.9 %)，P=0.000 6(17.15%比11.8%，PD-1)。(图1 A～C为代表性的流式图，图D～E为统计分析图)。三阴性BC患者外周血CD4+T淋巴细胞上Tim-3+PD-1+的表达水平为2.23%(0.52%～26.6%)，明显高于其在健康对照组外周血中的表达水平1.13%(0.14%～5.52%)，差异有统计学意义(P=0.006 6)(图1F)。

图1 三阴性BC患者外周血CD4阳性细胞上Tim-3和PD-1的表达水平与健康对照组比较

2.3 三阴性BC患者肿瘤组织与癌旁组织中CD4+T淋巴细胞上Tim-3和PD-1的表达差异 CD4+T细胞上Tim-3在肿瘤组织中的表达明显高于其在癌旁组织中的表达(27.2%比7.8%，P=0.000 6)，CD4+T细胞上PD-1在肿瘤组织中的表达亦明显高于其在癌旁组织中的表达(44.05%比23.24%，P=0.006 9)，代表性的流式图见图2(A～C)，汇总的7个患者的统计图见图2(D～E)。进一步分析组织中CD4+T淋巴细胞上Tim-3和PD-1的共表达情况，结果显示：CD4+T细胞上Tim-3+PD-1+在肿瘤组织中的表达明显高于其在癌旁组织中的表达(25.43%比7.28%，P=0.002 9)。三阴性BC患者肿瘤组织CD4+T淋巴细胞上Tim-3+PD-1+的表达明显高于其在外周血中的表达(25.43%比5.78%，P=0.003 9，见图2)。癌旁组织中CD4+T淋巴细胞上Tim-3+PD-1+的表达与其在外周血中的表达差异无统计学意义(7.28%比5.78%，P=0.052 5)。

图2 三阴性BC患者癌组织、癌旁组织及其外周血中CD4阳性细胞上Tim-3和PD-1表达水平的比较

2.4 三阴性BC患者外周血CD4+T细胞上Tim-3+PD-1+表达水平与临床资料的关系 由于Ⅰ期患者较少，本研究将Ⅰ期和Ⅱ期患者合并，入选的52例患者按照AJCC分期，Ⅰ/Ⅱ期患者共33例，Ⅲ/Ⅳ期三阴性BC患者19例，中分化及分化好的患者35例，低分化患者17例。Ⅲ/Ⅳ期三阴性BC患者外周血CD4+T淋巴细胞中Tim-3+PD-1+细胞的表达水平3.23%(0.7%～26.6%)高于Ⅰ/Ⅱ期患者的表达水平1.66%(0.52%～18.2%)，差异有统计学意义(P=0.021 6)。Ⅲ/Ⅳ期三阴性BC患者外周血CD4+T淋巴细胞中Tim-3+PD-1+细胞的表达水平亦明显高于健康人的水平(3.23%比1.13%，P=0.001 6)，见图3A。Ⅰ/Ⅱ期三阴性BC患者外周血CD4+T淋巴细胞中Tim-3+PD-1+细胞的表达水平稍高于健康人，但与健康人相比，差异无统计学意义(1.66%比1.13%，P=0.052 4)。中分化及分化好的患者外周血CD4+T淋巴细胞中Tim-3+PD-1+细胞的表达水平与低分化患者相比，差异无统计学意义(P=0.450 9)。见图3B。

图3 三阴性BC患者外周血中CD4+T淋巴细胞上Tim-3 和PD-1表达水平与临床资料的关系

3 讨论

T淋巴细胞在人体细胞免疫过程中发挥重要作用。大量的研究已经证实，调节T淋巴细胞活性的免疫调节因子(共刺激因子和共抑制因子)之间的相互作用，可以影响机体的免疫反应[6]。CD4+T细胞不仅可对CD8+T细胞的激活和增殖提供“辅助”，还可直接杀伤肿瘤细胞，在感染、免疫调节过程中也发挥重要作用[7]。

本研究发现三阴性BC患者外周血CD4+T细胞中Tim-3和PD-1的表达明显高于健康人，这一研究结果与以往报道的在滤泡性淋巴瘤、口腔鳞癌及卵巢癌患者中的研究结果[8-9]一致。此外，Tim-3的高表达不仅存在于肿瘤患者体内，在一些病毒感染的患者体内也存在Tim-3的高表达。HIV感染患者耗竭的CD4+T细胞上也高表达Tim-3，相似的在HCV、HBV感染患者耗竭的T细胞上也都有Tim-3的表达[10]。

在慢性HCV感染时，CD4+和CD8+T细胞上Tim-3均升高，且大部分细胞为Tim-3+PD-1+。与慢性病毒感染时一样，在小鼠BC和恶性黑色素瘤的肿瘤浸润组织CD4+和CD8+淋巴细胞上可见Tim-3和PD-1共表达[11]。本研究结果显示，三阴性BC患者外周血CD4+T细胞中Tim-3+PD-1+的表达亦明显高于健康人，这一结果与恶性黑色素瘤患者研究结果一致，提示Tim-3+PD-1+的表达可能导致CD4+T细胞的功能耗竭，可能是CD4+T细胞参与肿瘤细胞免疫逃逸、促进BC疾病进展的机制之一。

三阴性BC患者肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞上Tim-3+PD-1+的表达明显高于其在癌旁组织和外周血中的表达，提示肿瘤微环境中可能存在诱导Tim-3和PD-1表达的细胞因子，进而导致CD4+T细胞功能障碍，导致肿瘤细胞免疫逃逸，促进肿瘤发展。因此，了解和研究肿瘤组织、癌旁组织中Tim-3和PD-1的表达及功能可能更能反映肿瘤的发生发展情况。Zhu等[12]近期研究了Tim-3+在BC患者CXCL13浸润的CD4辅助细胞上Tim-3的表达，但未分析Tim-3和PD-1在外周血与肿瘤组织中表达的差异。研究发现，非小细胞肺癌患者PD-1+CD4+的表达与肿瘤分期相关[13]。Wang等[14]则分析了Tim-3多态性与中国人患BC的易感性之间的关系，发现TIM-3上rs10053538可能增加BC的易感性，并促进其病情发展，但并未分析Tim-3与BC临床分期的关系。

本研究发现Ⅲ/Ⅳ期三阴性BC患者外周血CD4+的细胞中Tim-3+PD-1+细胞的表达水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者的水平，也明显高于健康人的水平，而Ⅰ/Ⅱ期患者的水平与健康人相比无明显差别，提示Tim-3+PD-1+CD4+的表达可能与三阴性BC的病情进展和肿瘤负荷有关。此外，Tim-3+PD-1+CD4+的表达水平在晚期肿瘤患者体内增高也可能和肿瘤微环境有关。Ⅰ/Ⅱ期患者的水平仅轻度升高，但与健康人相比无明显差别，这可能与肿瘤发展初期循环外周血中肿瘤抗原少，抗原刺激所产生的特异性T细胞活性较好，抑制性信号较弱，T细胞清除异常抗原的功能并没有明显改变。另一方面，这也可能和样本量少有关。此外，通过分析发现，CD4上Tim-3的表达与三阴性BC的组织分化程度不相关。

此项研究结果丰富了人们对Tim-3和CD4+T细胞的认识，为临床医师分析肿瘤患者病情，理解三阴性BC的病情进展提供了重要参考。为进一步深入研究肿瘤组织对Tim-3和PD-1的影响奠定了实验基础。随着研究的不断深入，Tim-3在慢性病毒感染和肿瘤免疫逃逸中的作用及相关机制会逐步得到阐明，进而临床上可以靶向Tim-3治疗肿瘤，利用抗Tim-3抗体治疗自身免疫病和移植排斥，并不断为移植免疫排斥、肿瘤靶向治疗、肿瘤疫苗的应用等,提供新的治疗技术。

[1] Torre L A, Bray F, Siegel R L, et al. Global Cancer Statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[2] Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer Statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

[3] Gros A, Robbins P F, Yao X, et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors[J]. J Clin Invest, 2014, 124(5):2246-2259.

[4] Zhu C, Anderson A C, Kuchroo V K. TIM-3 and its regulatory role in immune responses[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2011, 350:1-15.

[5] Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan J M, et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity[J]. J Exp Med, 2010, 207(10):2187-2194.

[6] Freeman G J, Casasnovas J M, Umetsu D T, et al. TIM genes: a family of cell surface phosphatidylserine receptors that regulate innate and adaptive immunity[J]. Immunol Rev, 2010, 235(1):172-189.[7] Ma C S, Wong N, Rao G, et al. Unique and shared signaling pathways cooperate to regulate the differentiation of human CD4+T cells into distinct effector subsets[J]. J Exp Med, 2016, 213(8):1589-1608.[8] Brower V. Checkpoint blockade immunotherapy for cancer comes of age[J]. J Natl Cancer Inst, 2015, 107(3):djv069.

[9] Rosenberg S A. Raising the bar: the curative potential of human cancer immunotherapy[J]. Sci Transl Med, 2012, 4(127):127.

[10]Kassu A, Marcus R A, D’Souza M B, et al. Regulation of virus-specific CD4+T cell function by multiple costimulatory receptors during chronic HIV infection[J]. J Immunol, 2010, 185(5):3007-3018.

[11]Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan J M, et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity[J]. J Exp Med, 2010, 207(10):2187-2194.

[12]Zhu S, Lin J, Qiao G, et al. Tim-3 identifies exhausted follicular helper T cells in breast cancer patients[J]. Immunobiology, 2016, 221(9):986-993.

[13]韦腾飞, 张军, 吴豫, 等. CD4+T细胞表面共抑制分子的表达水平与非小细胞肺癌疾病进展的关系[J]. 中华肿瘤杂志, 2014, 36(6):424-429.

[14]Wang Z, Liu X, Wang X, et al. Polymorphisms in TIM-3 and breast cancer susceptibility in chinese women: A case-control study[J]. Oncotarget, 2016, 7(28):43703-43712.

Expression and clinical significance of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes in three-negative breast cancer patients

Xu Benling, Yuan Peng, Chen Guangyu, Wang Zhenlei, Yuan Long

(TheAffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China)

Objective To detect the expression of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes in three-negative breast cancer (BC) patients and investigate their potential relationship with the progression of BC. Methods Fifty-two patients with three-negative BC in Department of Breast Surgery, the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University from January of 2013 to January of 2014 were enrolled. All the Peripheral blood and 7 cases of tumor and paraneoplastic tissues from surgically treated BC patients were obtained. The expression of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes were analyzed by flow cytometry. Results The frequencies of Tim-3+cells, PD-1+cells and Tim-3+PD-1+cells among CD4+cells were significantly higher in BC patients than those in the 22 healthy donors (Tim-3: 2.74%vs1.7%,P=0.026 4; PD-1: 17.15%vs11.8%,P=0.000 6; Tim-3+PD-1+: 2.23%vs1.13%,P=0.006 6). Significant difference was observed for the Tim-3+PD-1+CD4+percentage in stage Ⅲ/Ⅳ patients compared to the patients with stage Ⅰ/Ⅱ (3.23%vs1.66%,P=0.021 6) and healthy donors. Compared with the matched paraneoplastic tissue and their counterparts in blood, the percentage of Tim-3+cells, PD-1+cells and Tim-3+PD-1+cells in tumor-infiltrating CD4+T cells were significantly increased in the tumor tissues. Conclusion The frequencies of Tim-3+cells among CD4+cells were significantly increased in BC patients, indicating that Tim-3+PD-1+CD4+T cells may be one of the mechanisms related to immune escape of tumor cells, acceleration of the development of BC.【Key words】 Breast cancer; CD4+T-lymphocytes; T cell exhaust; Tim-3; PD-1

河南省医学科技攻关计划重大项目(201401016)；

河南省留学人员科研资助项目(豫留学函2015-5号)；

袁龙，E-mail：13673633569@163.com。

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.07.008

2016-09-07)

郑州市技术研究与开发经费支持项目(153PKJGG061)。