樱花新品种白玉吉野组培快繁技术研究

罗桂杰，金 倩，陈 芬

(江苏省农业科学院 宿迁农科所，江苏 宿迁 223800)

樱花新品种白玉吉野组培快繁技术研究

罗桂杰，金 倩，陈 芬

(江苏省农业科学院 宿迁农科所，江苏 宿迁 223800)

以白玉吉野当年生带腋芽茎段为外植体，进行了外植体的灭菌、启动、增殖和生根培养试验。试验结果表明：外植体灭菌消毒方法为75%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCl2浸泡6 min，成活率达51.33%；促进腋芽诱导最佳培养基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA，诱导率为72.65%；适宜的增殖最佳培养基配方：MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，增殖系数为5.76；诱导生根率最高的培养基配方为MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，生根率达92.02%。

白玉吉野;组培；快繁技术

樱花(Cerasus)隶属于蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoidea)。全世界共150余种，主要分布于北半球温带地区，多数种类分布于中国、日本和朝鲜。该植物资源丰富，有着丰富野生资源和栽培种类[1-2]，中国的野生樱花资源十分丰富，远远超过日本及相邻国家，分布范围很广，从东北到西南，都有樱花生长。目前，中国樱属植物超过50个种或变种，至今已发表中国樱属植物野生种(变种)双学名293个，已处理272个，21个学名未处理，需进一步研究[3]。

随着樱花的广泛应用，研究樱花的快速繁殖技术显得尤为重要，传统的繁殖方法有播种、嫁接等繁殖技术。观赏樱花从1991年开始，中国科学院武汉植物研究所做了樱花组织培养方面的研究，并且获得了正常的组培苗[4]。王文房等在6-BA和NAA两种激素配比诱导下，对樱花花柄进行组织培养，得到了最适合樱花花柄形成愈伤组织的激素浓度配比，结果表明：在MS培养基中加3.0～4.0 mg/L NAA和1.0～2.0 mg/L 6-BA最适合樱花花柄形成愈伤组织[5]。白玉吉野原产于日本，其花色为纯白色，目前我国多数景点应用中主要以粉色系樱花品种为主，在园林中特别缺少白色花系的品种。因此近几年我国从日本引进白玉吉野，由于这些品种量少价高，因而难以适应市场商品化生产的需求，严重限制了白玉吉野新品种的大面积推广。组织培养方法繁殖具有繁殖周期短、全年都能进行繁殖、繁殖系数高等特点，笔者以白玉吉野为试材，系统研究了不同激素及不同浓度诱导白玉吉野愈伤及不定芽的发生，找到影响无菌苗生长发育的制约因子和最佳的使用浓度，使其快繁技术进一步系统化，为白玉吉野产业化发展提供切实可行的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

白玉吉野采自宿豫区运河湾农科院樱花园，白玉吉野当年生、健壮无病虫害的嫩枝中上部位作为外植体，去掉叶片留叶柄。

1.2 培养条件

外植体的腋芽诱导、增殖培养和生根培养都在培养室内进行，基本培养基均加入30 g/L蔗糖、6.0 g/L琼脂、pH 5.8，培养室温度控制在25～26 ℃，日光灯光照强度1200 lx左右，光照时间为12 h/d。

1.3 方法

1.3.1 外植体前处理 用洗手刷蘸洗衣粉轻轻刷洗茎段表面及腋芽处，经自来水冲洗干净，再切成2～3 cm的小段，每段至少有一个侧芽，用自来水冲洗一遍。

1.3.2 外植体灭菌消毒 对植物材料进行前处理后，转入超净工作台进行如下消毒处理:70%乙醇浸泡10 s，然后用0.1% HgCl2加吐温2滴约0.01 mL浸泡，时间分别3、4、5、6、7、8 min，再用无菌水冲洗5遍。消毒后，将植物材料接种到培养基中，每瓶接1个。

1.3.3 腋芽诱导培养基的筛选 采用MS基本培养基，利用不同浓度的BA、IBA设计试验，BA的浓度为1.0、1.5、2.0 mg/L，IBA的浓度为0.1、0.2、0.3 mg/L，共9个组合(表2),定期观察有无污染情况，接种35 d后统计愈伤诱导及生长情况,找出腋芽诱导效果最佳的配方。

1.3.4 增殖培养基的筛选 采用MS基本培养基，利用不同浓度的BA、NAA设计试验，BA的浓度为2.5、3.0、3.5 mg/L，NAA的浓度为0.1、0.2、0.3 mg/L共9个组合(表3)。选取生长一致、状况良好、紧密，带有绿色芽点的愈伤组织进行不定芽诱导与增殖试验。35 d后统计分化率、增殖系数，找出最佳增殖培养基配方。

1.3.5 生根培养基的筛选 选择2～3 cm高、生长健壮整齐一致的试管苗先在空白MS培养基上培养14 d左右，以消除前期激素对生根试验的影响，然后进行生根培养，基本培养基采用MS，利用不同浓度的BA、NAA设计试验，BA的浓度为0.5、1.0、1.5 mg/L，NAA的浓度为0.1、0.2、0.3 mg/L。35 d后统计无菌苗生根率、平均根数、平均根长。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌消毒

白玉吉野外植体在快繁中易污染而引起褐变，0.1% HgCl2合理的灭菌时间可达到较好的灭菌效果。灭菌时间过短，外植体的污染率过高，达不到灭菌的目的；灭菌时间过长会对外植体造成伤害，从而加重外植体的褐化，影响其成活率。

由表1可以看出，0.1% HgCl2消毒时间3 min时，灭菌不彻底，污染率高达100%，显著高于其他各处理，随着消毒时间增加，污染率逐渐降低；反之，褐化率随着消毒时间的增加而呈正向相关，但是消毒时间过长大于6 min时，外置体成活率逐渐降低，褐化死亡率比较高。因此，在消毒时间为6 min时，成活率最高达51.33%，与其他各处理间差异显著。由此看来，用0.1% HgCl2消毒6 min是比较理想的消毒方法。

表1 0.1% HgCl2不同消毒时间对 白玉吉野成活率的影响

注：LSD显著性检验，不同字母表示在0.05水平下差异显著。

2.2 腋芽诱导

表2中数据表明，在腋芽诱导的2种因素中，根据K值的大小，BA的作用最明显，其次是IBA的影响。因此，两者对腋芽诱导影响的主次关系为BA>IBA。

方差分析结果显示(表3)，BA的3个水平在影响腋芽诱导方面差异极显著，随着BA浓度的升高，诱导率增加。其次是IBA的作用，对腋芽诱导有显著影响。当IBA浓度为0.1 mg/L，腋芽愈伤组织出现较早，在接种12 d后出现愈伤，随着BA浓度的增加，诱导率随之增加，但愈伤生长状况普遍较差，早期颜色偏白色、密度小，后期褐化比较严重，芽点少；当IBA浓度为0.3 mg/L时，随着IBA浓度的增加，诱导率反而下降；IBA的浓度为0.2 mg/L时，随着BA浓度的增加，诱导率随之升高，当BA浓度为2.0 mg/L，诱导率虽然不是最高为72.65%，但愈伤组织生长状况良好，紧密、浅绿色，随着培养时间增加，有较多的小芽点。因此，促进腋芽愈伤组织分化的最佳培养基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA。

2.3 无菌苗增殖诱导

极差的大小反映了该因素对指标值影响的大小，极差大则该因素对指标值的影响大，极差小则该因素对指标值的影响小。为比较BA、NAA对不定芽诱导与增殖的影响，对这2个因素进行极差分析，极差分析结果表明，BA、NAA对增殖系数影响的主次关系为BA>NAA(表4)。

表2 不同激素浓度配比对腋芽诱导的影响

注：K1、K2、K3分别表示水平1、水平2、水平3的平均指标值，RC2表示增殖系数的极差。

表3 不同激素浓度配比对腋芽诱导影响的方差分析

方差分析结果显示(表5)，BA的3个水平在影响组培苗增殖方面差异极显著。随着BA浓度的升高，增殖系数随之下降，在BA浓度为2.5 mg/L时增殖系数和分化率都最高，对组培苗增殖培养的效果最佳。其次是NAA的作用，对组培苗增殖有显著影响，随着NAA浓度的增加，增殖系数先升高后降低，当NAA浓度为0.2 mg/L时增殖系数相对比较高。综上分析，无菌苗增殖最佳培养基配方：MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA。

表4 不同激素对不定芽诱导与增殖的影响

注：K1、K2、K3分别表示水平1、水平2、水平3的平均指标值，RC2表示增殖系数的极差。

2.4 生根诱导

表6中数据表明，BA、NAA对生根诱导的影响顺序是BA>NAA，这说明，影响生根效果的2个因素中BA的作用最明显，其次是NAA。由K值的大小可以看出，生根率随着BA浓度的增加而降低，而NAA对生根率的影响随着浓度的增加先升高后降低，当NAA浓度为0.2 mg/L时，生根率最高。

表5 不同激素对不定芽诱导与增殖影响的方差分析

由表7方差分析结果说明，BA浓度为1.0、1.5、2.0 mg/L 3个水平之间差异极显著。BA各浓度对组培苗生根的影响为0.5>1.5>2.0 mg/L，这说明0.5 mg/L BA是生根的最佳用量；NAA的浓度分别为0.1、0.2、0.3 mg/L时各浓度对生根影响的顺序是0.2>0.1>0.3 mg/L。由方差分析结果说明(表7)，NAA的3个浓度在诱导组培苗生根方面差异极显著，NAA浓度为0.2 mg/L时诱导组培苗生根率最高，当NAA浓度大于0.2 mg/L时，反而对组培苗的生根有一定程度的抑制作用。由此确定，诱导生根率最高的培养基配方为MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，生根率达92.02%。

表6 不同激素对组培苗生根的影响

注：K1、K2、K3分别表示水平1、水平2、水平3的平均指标值，R表示生根率的极差。

表7 不同激素对组培苗生根影响的方差分析

2.5 炼苗和移栽

当瓶苗的根长3～4 cm时，进行炼苗移栽。在移栽前，要先将瓶盖打开适应一个星期，然后小心取出苗，不要伤及根系，用自来水冲净根部培养基。移栽基质为黄心土∶蛙石按1∶1混合，栽后浇透水，并喷施800倍液多菌灵，盖膜保湿，遮阴网遮阴，保持温度在25 ℃左右，相对湿度80%左右。喷水2～3次/d，3 d后适当通风，7 d后去掉遮阴网并减少喷水次数。

3 结论与讨论

3.1 无菌体系的建立

70%乙醇和0.1% HgCl2混合使用作为消毒剂，是由于70%乙醇不能彻底杀菌，一般不能单独使用，但是70%乙醇的湿润作用强，可以排除掉材料表面的空气，有利于其他消毒剂的渗入，因此两者配合使用[6]。试验结果表明，0.1% HgCl2处理时间越短，消毒不彻底，外植体污染率越高；0.1% HgCl2消毒时间过长，虽然污染率降低，但外植体受到伤害，褐化死亡率增加。当消毒时间为6 min时，虽然外植体污染率不是最低，还存在一定的污染情况，但是此时腋芽成活率最高，显著高于其他各处理。因此，兼顾消毒效果及对外植体伤害程度我们筛选出75%乙醇10 s+0.1% HgCl26 min对外植体进行灭菌。

3.2 腋芽诱导

在本研究中，BA、IBA均可以提高腋芽培养的诱导率，BA的作用明显优于IBA的影响。当BA为2.0 mg/L，IBA为0.1 mg/L时，虽然增殖系数最高，但愈伤生长状况普遍较差，能够用于增殖培养的有效芽数量少。当IBA为0.2 mg/L时，诱导率虽然不是最高，但愈伤组织普遍生长状况良好，紧密、浅绿色，随着培养时间增加，有较多的小芽点。此时在培养基中添加BA，随着BA浓度的升高，启动率、有效增殖数均升高。因此，促进腋芽愈伤组织分化的最佳培养基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA。

3.3 增殖诱导

无菌苗的增殖研究是植物组培再生体系建立的关键环节，是植物快速增殖的根本。试验表明，低浓度的BA有利于腋芽的增殖，当其浓度过高时，幼苗呈半透明状、浅黄绿色、生长缓慢、叶片数少、玻璃化严重，这与珠美海棠(Maluszumi)[7]、芦荟(Aloeveravar. chinese)[8]在组织培养中研究的结果相一致。BA适宜浓度是2.5 mg/L，NAA浓度的变化对苗长势影响程度不明显，但对愈伤的影响较大，当NAA浓度高于0.2 mg/L时容易导致丛生芽形成大量愈伤组织，随着NAA浓度的升高，愈伤变得疏松，颜色由黄绿变为淡黄或白色(为无效愈伤)；而低于0.1 mg/L时芽分化少，长势慢。因此增殖效果最佳组合是BA浓度为2.5 mg/L、NAA浓度为0.2 mg/L，此时可获得增殖系数高、生长旺盛的丛生芽，有利于进一步进行生根培养。

3.4 生根培养

生根培养是试管苗快速繁殖的基础，国内外学者对于不同植物组培苗生根的研究做了大量的探索[9-11]。试验表明，随着BA浓度增加，试管苗生根的各项指标均相应降低，综合生根率、平均根数和平均根长3项指标，0.5 mg/L BA的生根效果最好。当BA浓度为0.5 mg/L时，随NAA含量的增加，生根率、平均根数和平均根长都是先增加后降低。当NAA含量为0.2 mg/L时，试管苗发根快，长度、粗度适中，并且颜色为黄白色，须根多，植株长势良好，因此诱导生根率最高的培养基配方为MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA。

[1] 王贤荣.中国樱花品种图鉴[M].北京：科技出版社，2014：7-12.

[2] Li C L, Bruce B.Cerasus[M]//Wu Z Y, Raven P H. Flora of China. Louis: Missouri Botanical Garden Press, 2003: 404-420.

[3] 伊贤贵.武夷山樱属资源调查及开发利用研究[D].南京：南京林业大学，2007.

[4] 谢春平.不同居群野生早樱形态特征及其群落学研究[D].南京：南京林业大学，2007.

[5] 王文房，李修岭.樱花花柄的组织培养[J].安徽农业科学，2006，34(22)：5839-5841.

[6] 曹孜义,刘国民.实用植物组织培养技术教程[M].兰州：甘肃科学技术出版社,1999.

[7] 李云,田亭,罗晓芳.珠美海棠试管苗玻璃化发生机理的初步研究[J].北京林业大学学报,1996,(1):52-58.

[8] 丰锋,李洪波,谢建英.芦荟组织培养中试管苗玻璃化的发生与防止[J].西南农业大学学报,2001,23(5):249-251.

[9] 李静.几种名贵观赏植物的快速繁殖[J].河北农业大学学报,1997,20(1):30-36.

[10] Klerk G J. Rooting of microcuttings: theory and practice[J]. In Vitro cell. Dev. Biol Plant, 2002, 38(5):415-422.

[11] Kris Pruski, Tess Astatkie, Jerzy Nowak.Tissue culture propagation of Mongolian cherry (Prunusfruticosa) and Nanking cherry (Prunustomentosa)[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2005, 82(2): 207-211.

(责任编辑：曾小军)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Technique of Oriental Cherry New Variety Baiyujiye

LUO Gui-jie, JIN Qian, CHEN Fen

(Suqian Institute of Agricultural Sciences, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Suqian 223800, China)

The one-year-old stems with axillary buds of oriental cherry new variety Baiyujiye were selected as explants, and the experiments in the sterilization, initiation, proliferation and rooting culture of the explants were carried out. The results showed that the best sterilization procedure for explants was 0.1% HgC12for 6 minutes after 75% alcohol for 30 seconds, and their survival rate could reach 51.33%. The optimal medium for the inducement of axillary bud was MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA, and the inducement rate was 72.65%. The optimum medium for the proliferation was MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA, and the proliferation coefficient was 5.76. The best medium for the rooting was MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA, and the rooting rate reached 92.02%.

Oriental cherry Baiyujiye; Tissue culture; Rapid propagation

2017-02-24

2016年江苏省宿迁市农业科技自主创新资金项目(SQCX2016-03)。

罗桂杰(1981─)女，江苏宿迁人，助理研究员，硕士，从事林木、果树、花卉方面的研究。

Q949.751.8

A

1001-8581(2017)07-0044-04