水中铜绿假单胞菌盲样考核结果与分析

唐轶君，张建军，李晶，宁鑫思，蒋丽娜

（四川省食品药品检验检测院，四川成都610199）

水中铜绿假单胞菌盲样考核结果与分析

唐轶君，张建军，李晶，宁鑫思，蒋丽娜

（四川省食品药品检验检测院，四川成都610199）

为客观反映包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测能力，保证检测结果的准确性，本文依据国家标准GB/T 8538-2008和盲样考核作业指导书，对某包装饮用水样品进行处理和铜绿假单胞菌检验，用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）和API 20NE对检验结果进行鉴定。结果表明：编号为5664、5663、5676、5679和5671的样品未检出铜绿假单胞菌，编号为5683、5669、5675、5696和5682的样品检出铜绿假单胞菌。总的来看，10个样品的检测结果均为满意。

包装饮用水；铜绿假单胞菌；盲样考核

铜绿假单胞菌俗称绿脓杆菌，在自然界中分布广泛，为淡水和土壤中最常见的细菌种类之一，空气、动物皮肤、肠道、呼吸道等处均可有该菌的存在。铜绿假单胞菌可通过水源、土壤、工器具、接触等多种途径传播，并对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境有极强的抵抗力[1]。研究表明，铜绿假单胞菌可以产生多种外毒素、内毒素等致病因子，是导致人类急性肠道疾病和皮肤炎症的完全致病菌。老弱病幼孕等抵抗力较差的人群，饮用或使用铜绿假单胞菌污染的包装饮用水存在健康风险[2]。现阶段，我国国家标准GB 19298-2014《食品安全国家标准包装饮用水》、GB 8537-2008《饮用天然矿泉水》中，均明确规定每250mL水样中铜绿假单胞菌不得检出[3，4]。

为了解和证明四川省食品药品检验检测院实验室对包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测水平和检测能力，为实验室对水中铜绿假单胞菌的检测提供外部质量保证，增强客户及相关委托方对实验室出具可靠数据的信心，四川省食品药品检验检测院参加了由中国食品药品检定研究院组织的包装饮用水中铜绿假单胞菌盲样考核定性检验，并取得了满意的成绩。

1 材料与方法

1.1 待测样品

包装饮用水中铜绿假单胞菌盲样考核定性检测样品，为10个装有菌球的小西林瓶和10瓶瓶装水。10个小西林瓶上的样品编号和10瓶瓶装水上的样品编号为一一对应关系，分别为5679、5664、5676、5682、5683、5671、5663、5696、5669和5675，由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 培养基及试剂

CN琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司；营养琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司；革兰氏染液，北京陆桥技术有限责任公司；氧化酶试纸，广东环凯微生物科技有限公司；APⅠ 20NE，法国梅里埃公司；乙酰胺肉汤，北京陆桥技术有限责任公司；甲酸（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA），德国布鲁克公司（Bruker Daltonics）；细菌实验标准品（Bacterial Test Standard，BTS），德国布鲁克公司（Bruker Daltonics）。

1.3 仪器及耗材

0.45 μm滤膜，浙江泰林生物技术股份公司；多联过滤系统，德国SARTORⅠUS公司；恒温培养箱，美国THERMO公司；暗箱式紫外透射仪，上海顾村电光仪器厂；光学显微镜，日本OLYMPUS公司；BⅡ生物安全柜，北京东联哈尔公司；MALDⅠ-TOF-MS/MS（Autoflex Speed），BioTyper、FlexAnalysis分析软件，德国布鲁克公司。

1.4 检测方法

按照包装饮用水中铜绿假单胞菌定性检验样品作业指导书的要求和GB/T 8538-2008《饮用天然矿泉水检测方法》[5]对样品进行检测。并使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDⅠ-TOFMS）进行快速筛查，用APⅠ 20NE对检验结果进行鉴定。同时以ATCC 27853铜绿假单胞菌作为阳性对照菌株，以ATCC 25922大肠埃希氏菌作为阴性对照菌株进行试验。过滤水样的同时增加一组已灭菌水样作为空白对照。

实验室接到样品后立即进行检测。在生物安全柜内将装有水的瓶子打开，打开与水瓶上批号相同的西林瓶，将西林瓶内菌球倒入水瓶内，充分混匀后使用滤膜过滤。将过滤水样后的滤膜以无菌操作移放在CN琼脂培养基上。依此法分别对10件样品进行处理。

将平板置于（36±1）℃培养48h，在培养24h时观察一次结果，在培养48h时再观察一次结果。

1.5 结果观察

观察滤膜上是否有蓝色或绿色的菌落、红褐色菌落，如有其他颜色菌落，则放在365nm紫外光下观察。挑取平板上的蓝色或绿色菌落和产荧光的淡黄色菌落，接种营养琼脂平板，（36±1）℃培养24h。挑取营养琼脂平板上的单菌落，进行革兰氏染色、氧化酶试验，并接种乙酰胺肉汤试验管，（36±1）℃培养24h，然后向每支乙酰胺肉汤试验管中滴入一两滴钠氏试剂，检查各管产氨情况。

1.6 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）鉴定

用一次性接种环挑取营养琼脂平板上单菌落少许菌体，在MTP 384 Ground Steel靶板的靶点内涂布成一个薄层，在上述样品点上覆盖1μL 70%的甲酸溶液后在室温下自然晾干（约10min），再在其上覆盖1μL的HCCA溶液，并在室温下自然晾干（约10min）。

仪器参数如下：Smartbeam-Ⅱ激光器，线性正离子（LP）采集模式，加速电压为19.50kV，延迟提取电压为18.15kV，聚焦电压为7.00kV，质量范围为2 000～20 000Da，激光频率为500Hz。每次试验前用标准品溶液BTS进行质谱仪的质量校正。将靶板送入MALDⅠ-TOF-MS/MS进样仓，用FlexControl进行质谱采集，并用BioTyper、FlexAnalysis分析软件进行比对鉴定分析。

1.7 API 20NE鉴定

用一次性接种环挑取营养琼脂平板上单菌落少许菌体，依照APⅠ 20NE的说明书，对其进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 结果观察和初步鉴定

观察CN平板上的滤膜，结果如表1所示。样品5679、5664、5676、5671和5663在CN平板上为黄色菌落，在365nm紫外光下观察为有荧光菌落，镜检观察为革兰氏阴性，无芽胞杆菌，乙酰胺肉汤结果为阴性，氧化酶试验为阳性。样品5682、5383、5693、5669和5675为绿色菌落，镜检观察为革兰氏阴性，无芽胞杆菌，乙酰胺肉汤结果为阳性，氧化酶试验为阳性。同时进行检验的阳性对照平板ATCC 27853铜绿假单胞菌，在CN平板上菌落形态为绿色菌落，镜检为革兰氏阴性，无芽胞杆菌，乙酰胺肉汤反应为阳性，氧化酶试验阳性。阴性对照平板ATCC 25922大肠埃希氏局，在CN平板上未生长。检查ATCC 25922大肠埃希氏菌的工作菌株，镜检结果为革兰氏阴性无芽胞杆菌，乙酰胺肉汤结果为阴性，氧化酶试验为阴性。空白对照的平板上结果也为未生长。

表1 CN平板上的菌落形态和初步鉴定结果

2.2 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）鉴定结果

用仪器配套软件BioTyper将获得的质量图谱与标准菌株图谱库进行比对鉴定，比对分值及鉴定水平见表2。其中标准菌株ATCC 27853铜绿假单胞菌的鉴定结果为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），样品5682、5383、5693、5669和5675鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），样品5679、5664、5676、5671和5663鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）或是蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）。

2.3 API 20NE鉴定结果

参照APⅠ 20NE的使用说明书，对样品进行鉴定，结果见表3。其中，标准菌株ATCC 27853铜绿假单胞菌的鉴定结果为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），样品5679、5664、5676、5671和5663鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），样品5682、5383、5693、5669和5675鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

3 讨论

积极参加盲样考核和能力验证活动，是对实验室技术能力和管理状况进行考核的方法之一，是保障实验室资质认定工作质量有效性的重要手段，对实验室质量控制有着非常重要的意义。从2015年GB 19298-2014《食品安全国家标准包装饮用水》[3]开始实施以来，四川省食品药品检验检测院实验室连续2a对四川省内的包装应用水进行抽样检验，发现铜绿假单胞菌的检出率较高。为了解四川省食品药品检验检测院实验室对铜绿假单胞菌检验能力的真实水平，增加客户及相关方对实验室出具数据的信心，证明实验室对铜绿假单胞菌的检验能力，参加了此次由中国食品药品检定研究院组织的包装饮用水中铜绿假单胞菌盲样考核定性检验活动，盲样考核结果为满意。

本次试验除了使用了GB/T 8538-2008《饮用天然矿泉水检验方法》[5]对铜绿假单胞菌进行检验外，依据此次盲样考核发放的作业指导书，对样品中检出的可以菌落都使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDⅠ-TOF-MS）和APⅠ 20NE试纸条进行了生化鉴定。

MALDⅠ-TOF-MS是通过采集微生物菌体经软电离后产生的蛋白质、多肽等组分的加氢离子质谱图，利用图谱分析软件与数据库中的标准菌株质谱图进行比对以获得鉴定结果的生物质谱技术，具有检测速度快、通量高、耗材成本低、灵敏度和准确度高等优势。崔学文等[6]曾指出对铜绿假单胞菌良好的鉴定效果。但本文中使用的阴性对照菌株奇异变形杆菌、布氏柠檬酸杆菌、大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌均为氧化酶阴性的杆菌。从本次试验结果可以看出，MALDⅠ-TOF-MS可以很好地鉴定出铜绿假单胞菌，但对恶臭假单胞菌这类氧化酶阳性，且与铜绿假单胞菌同源性较高的菌株，则很难分辨出其种类。相比之下，APⅠ 20NE能很确定地给出恶臭假单胞菌的结果。说明APⅠ 20NE对氧化酶阳性的革兰氏阴性杆菌的鉴定能力较为可靠，MALDⅠ-TOF-MS检验过程简单，速度快，可以很好地分辨出铜绿假单胞菌与非铜绿假单胞菌，对大批量桶装饮用水进行检测时，可以使用MALDⅠ-TOF-MS进行初筛，若要获得更准确的试验结果，非目标菌进行确认，则需要APⅠ 20NE的辅助。

表2 MALDI-TOF-MS鉴定结果

表3 API 20NE鉴定结果

4 结论

本文依据国家标准GB/T 8538-2008和盲样考核作业指导书，用MALDⅠ-TOF-MS和APⅠ 20NE对包装饮用水中铜绿假单胞菌进行鉴定，结果表明检测结果均为满意。

[1]马群飞.瓶装饮用水铜绿假单胞菌污染研究进展[J].微生物学免疫学进展,2003,31(2):95-98.

[2]陈松,李红,李德华,等.桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况分析[J].现代预防医学,2015,42(6):1129-1130,1135.

[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB 19298-2014食品安全国家标准包装饮用水[S].北京:中国标准出版社,2014.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB 8537-2008饮用天然矿泉水[S].北京:中国标准出版社,2008.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 8538-2008饮用天然矿泉水检验方法[S].北京:中国标准出版社,2008.

[6]崔学文,罗慧萍,李增婷,等.基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱在铜绿假单胞菌鉴定中的应用[J].现代预防医学,2016,43(10):1862-1867.

Results and Analysis of Pseudomonas aeruginosa Blind Samples in Water

Tang Yi-jun,Zhang Jian-jun,Li Jing,Ning Xin-si,Jiang Li-na
(Sichuan Institute of Food and Drug Control,Sichuan Chengdu 610199)

In order to objectively reflect the detection capability of Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water,and ensure the accuracy of the results of laboratory tests,the laboratory of Sichuan Institute of Food and Drug Control participated in the Pseudomonas aeruginosa blind samples test in water organized by National Institutes for Food and Drug Control.The samples were handled and inspected by GB/T 8538-2008 and the blind samples instructions,identified and analyzed by MALDI-TOF-MS and API 20NE.The results showed that Pseudomonas aeruginosa were not detected in Code 5664,5663,5676,5679 and 5671,Pseudomonas aeruginosa were detected in Code 5683,5669,5675,5696 and 5682.Overall,the results of the ten samples were satisfactory.

Packaged drinking water;Pseudomonas aeruginosa;Blind samples test

R155

A

2096-0387（2017）03-0046-04

唐轶君（1984-），女，硕士，工程师，研究方向：食品微生物检验。