拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的克隆与生物信息学分析

翟逸，刘钦松，石党委，吴永坤，张念强，祁庆生

（1.重组蛋白基因检测技术国家地方联合工程实验室，山东博奥克生物科技有限公司，山东聊城252000；2.山东大学生命科学学院，微生物技术国家重点实验室，山东济南250100）

拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的克隆与生物信息学分析

翟逸1，刘钦松1，石党委1，吴永坤1，张念强1，祁庆生2

（1.重组蛋白基因检测技术国家地方联合工程实验室，山东博奥克生物科技有限公司，山东聊城252000；2.山东大学生命科学学院，微生物技术国家重点实验室，山东济南250100）

以拟南芥总RNA为模板，利用RT-PCR的方法从拟南芥中扩增获得一条4-香豆酰-CoA连接酶基因完整的cDNA序列，命名为4CL1。利用生物信息学生物软件对其核酸和蛋白质序列进行分析，结果表明，该序列长1 686bp，与已报道的拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的序列相似性达到98%～100%，氨基酸序列相似性为99%～100%；4CL1基因编码561个氨基酸，该氨基酸序列具有典型的4-香豆酰-CoA连接酶AMP-binding保守结构域LPYSSGTTGLPK，同时含有该蛋白家族的催化活性中心GEICIRG序列；预测的分子量为61.05kDa，理论等电点为5.25，不稳定参数为35.93，在分类上属于稳定性蛋白；二级结构主要以无规则蜷曲、α-螺旋、延伸链及β转角为主，其含量分别为34.22%、30.30%、24.06%和11.41%。

拟南芥；4-香豆酰-CoA连接酶；基因克隆；序列分析

白藜芦醇（Resveratrol，Rs），一种具有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，主要存在于葡萄、花生、桑椹和虎杖等植物中[1]。研究发现，白藜芦醇具有抗衰老、抗肿瘤、预防心血管疾病，抗神经性病变及可提高机体免疫力等多种生物活性，在食品、保健品、化妆品及生物制药等行业中具有很大的应用潜力和广阔的发展前景[2-5]。在植物体中，白藜芦醇通过苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H），4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）和白藜芦醇合酶（RS）4种酶来合成，其中4CL是合成途径中的关键酶，其催化一分子的4-香豆酸和一分子的丙二酰-CoA生成一分子的4-香豆酰CoA，作为下一步合成白藜芦醇的底物[6，7]。

近年来，随着合成生物学与代谢工程的迅速发展，利用微生物合成具有重要应用价值的植物源代谢产物越来越受到研究者的重视[8]。已有研究表明，在微生物中以4-香豆酸为底物，仅表达4-香豆酰CoA连接酶和白藜芦醇合酶就能够合成白藜芦醇[9-12]。本研究以拟南芥总RNA为模板，利用RT-PCR扩增获得4-香豆酰CoA连接酶的基因，并对其进行了序列比对及生物信息学等相关分析，为下一步利用基因工程技术进行白藜芦醇的生物合成提供了基因资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

拟南芥种子（Arabidopsis thaliana）由聊城大学曹雪松教授馈赠；DP432植物总RNA提取试剂盒、大肠杆菌DH5a感受态细胞、分子量标准D15000+2 000 DNA Marker为天跟生化科技（北京）有限公司产品；PrimeScript™ ⅠⅠ 1st Strand cDNA Synthesis Kit；TaKaRa LA Taq®；Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0；Takara pMD™18-T Vector Cloning Kit；TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0；T4 DNA Ligase为宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白胨，酵母膏，NaCl等试剂均为分析纯，购于青岛浩赛科技股份有限公司。

1.2 实验仪器

TECHNE PC仪（TC-512）购于英国Bibby Scientific Ltd；水平电泳仪（DYCP）购于北京六一仪器厂；全自动数码凝胶成像分析系统（Tanon 1600R）购于上海天能科技有限公司；多功能台式高速离心机（5430R）购于上海艾本德生物技术国际贸易有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50A）、电热鼓风干燥箱（BGZ-240）等购于上海博迅实业有限公司；智能恒温循环器（DTY-5A）购于北京德天佑科技发展有限公司；电子天平（JE203）购于上海浦春计量仪器有限公司；pH计（PHS-3C）购于上海虹益仪器仪表有限公司；超净工作台（DTY-900）购于苏州苏洁净化设备有限公司。

1.3 方法和步骤

1.3.1 拟南芥总RNA的提取

将拟南芥幼苗从无菌玻璃培养瓶中取出，用剪刀去掉根部后放入预先以DEPC水浸泡并高温处理过的研钵中，加入适量液氮迅速研磨至粉末状，取适量转至无核酶的1.5mL EP管中，根据植物总RNA提取试剂盒操作使用说明书提取拟南芥总RNA，-80℃冰箱保存备用。

1.3.2 4-香豆酰-CoA连接酶基因RT-PCR扩增

以1.3.1中提取的拟南芥总RNA为模板，按照PrimeScript™ ⅠⅠ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行逆转录，以合成的第一链cDNA为模板，4CL1-F：5'-ATGGCGCCACAAGAACAAG-3'、4CL1-R：5'-TCACAATCCATTTGCTAGT-3'为引物进行PCR扩增，反应体系总体积为50.0μL，包括5.0μL缓冲Buffer，8.0μL的dNTPs，各5.0μL的4CL1-F、4CL1-R，5.0μL的cDNA模板，21.5μL灭菌ddH2O和0.5μL的LA Taq酶；PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸120s，35个循环；最后72℃延伸10min；反应完毕，取适量PCR扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3.3 PCR扩增片段的TA克隆与测序

将PCR扩增产物进行凝胶电泳，以琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段并与pMD™18-T克隆载体进行连接，其反应体系为：pMD™18-T Vector 1.0 μL，纯化目的片段4.0μL，Solution Ⅰ连接反应液5μL。将上述反应体系缓慢混合均匀，在4℃条件下过夜连接。将10μL的连接产物加入E.coliDH5α感受态细胞中，经热击转化后涂布氨苄抗性平板，37℃过夜培养；挑取白色单克隆进行液体培养、质粒提取，经PCR扩增验证重组质粒中插入片段大小正确后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3.4 拟南芥4CL1基因序列生物信息学分析

在NCBⅠ中利用BLAST与保守结构域查询（Conserved Domain Search，CD Search）在线程序等对4CL1基因进行序列比对及保守结构域查询；DNAMAN 5.22与Clustal X等生物学软件进行多序列比等分析；4CL1蛋白的一级结构、二级结构及理化性质等预测通过ExPASY ProtParam Server在线服务器进行，三级结预测采用自动建模的方式在SWⅠSSMODEL服务器上进行。

2 结果与分析

2.1 拟南芥总RNA的提取检测

提取的拟南芥总RNA电泳检测结果如图1所示，从上往下依次为28S、18S和5S的RNA。从图1可以看出，28S、18S条带完整、清晰，5S条带则非常暗淡。这表明提取的拟南芥总RNA无降解，质量较高，可满足下一步目的基因扩增的实验要求。

图1 拟南芥总RNA电泳检测

2.2 拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因4CL1的克隆

将提取的拟南芥总RNA逆转录合成第一链cDNA，然后以cDNA为模板，4CL1-F和4CL1-R为引物，经PCR扩增获得一条约1 700bp的特异性电泳条带，如图2所示，其大小与预期扩增产物（1 686bp）相符。

图2 4-香豆酰-CoA连接酶基因4CL1的PCR扩增

2.3 重组质粒的构建与筛选

在凝胶成像系统下将2.2中的特异性扩增电泳条带切下，纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化E.coliDH5α并涂布在含有ⅠPTG、X-gal和氨苄青霉素抗性的筛选平板上。培养后从平板上挑取白色单克隆转接于含氨苄青霉素抗性的液体LB中过夜培养并提取质粒。以提取的质粒为模板，4CL1-F和4CL1-R为引物，经PCR扩增获得一条与图2中特异性条带大小一致的电泳条带，如图3所示。这表明，目的片段已成功插入到克隆载体中，重组质粒构建成功。

图3 重组质粒的PCR扩增验证

2.4 4CL1基因的序列分析

阳性重组质粒的测序结果表明，插入片段包含一个完整的开放阅读框，片段的大小为1 686bp，将其命名为4CL1。在NCBⅠ中BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）的序列比对结果表明，该序列与NCBⅠ中已报道的拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的序列相似性达到98%～100%，其中与NM_104046.3、AY376729.1、AY099747.1、U18675.1序列完全相同；翻译的氨基酸序列相似性为99%～100%。这表明所克隆片段为拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因，其核酸与翻译的氨基酸序列如图4所示。

图4 4CL1基因的核酸序列和翻译的氨基酸序列

2.5 4CL1基因的生物信息学分析

2.5.1 一级结构预测与分析

拟南芥4-香豆酰CoA连接酶4CL1基因编码的4CL1蛋白由561个氨基酸残基组成，预测的分子量为61.05kDa，理论等电点为5.25。该蛋白计算的不稳定参数为35.93，属于稳定性蛋白，这有利于后续的蛋白表达、纯化等研究工作。

2.5.2 4CL1基因结构域分析

4-香豆酰-CoA连接酶属于AMP结合超家族蛋白，通过NCBⅠ在线软件对4CL1基因氨基酸序列的结构域分析结果如图4所示。如图4所示，该氨基酸序列具有典型的4-香豆酰-CoA连接酶的AMP-binding保守结构域LPYSSGTTGLPK，同时含有该蛋白家族的催化活性中心GEⅠCⅠRG序列[13，14]。这进一步说明所克隆基因为4-香豆酰-CoA连接酶基因。

2.5.3 二级结构预测与分析

ExPASY ProtParam Server在线服务器对4CL1蛋白二级结构预测结果如图5所示。从图5可以看出，该4CL1蛋白的二级结构以无规则蜷曲、α-螺旋、延伸链及β转角为主，其中无规则蜷曲含量为34.22%，α-螺旋含量为30.30%，延伸链含量为24.06%，β转角含量为11.41%。

图5 4CL1蛋白的二级结构预测

2.5.4 三级结构预测与分析

将4CL1蛋白序列在SWⅠSS-MODEL服务器中经BLAST比对搜索，获得了一条序列相似性为73.33%的模板5bsr.1.A，如图6所示。采用自动建模方式，以5bsr.1.A为模板预测4CL1蛋白的三级结构如图7所示。从图6、7中可以看出，在该结构中含有较多的无规则蜷曲和α-螺旋和，这也与图5中4CL1蛋白的二级结构预测结果相符合。

图6 模板5bsr.1.A三级结构

图7 预测的4CL1蛋白三级结构

3 结论

在前期的工作中，已成功获得了白藜芦醇合酶的基因。本研究通过RT-PCR扩增从拟南芥总RNA中获得一条长度为1 686bp的基因片段，命名为4CL1，其在GenBank中的登录号为KX817185。该基因片段的核酸和翻译的氨基酸序列与NCBⅠ中已报道的拟南芥来源的4-香豆酰CoA连接酶相似性分别达到98%～100%和99%～100%，并且具有典型的4CL蛋白中保守的特征序列SSGTTGLPKGV和GEⅠCⅠRG，这些结果表明本文分离的4CL1基因为拟南芥的4-香豆酰CoA连接酶基因。这为下一步利用基因工程的方 法进行生物合成白藜芦醇奠定了基础。

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Cloning and Sequence Analysis of a 4-coumaryl: CoA ligase Gene from Arabidopsis thaliana

Zhai Yi1,Liu Qin-song1,Shi Dang-wei1,Wu Yong-kun1,Zhang Nian-qiang1,Qi Qing-sheng2
(1.State and Local Joint Engineering Laboratory of Recombinant Protein and Gene Detection Technology,Shandong Boaoke Biotechnology Co.,Ltd.,Shandong Liaocheng 252000;2.State Key Laboratory of Microbial Technology,College of Life Science,Shandong University,Shandong Jinan 250100)

A complete cDNA sequence of 4-coumaryl:CoA ligase1 gene was obtained from Arabidopsis thaliana total RNA by RT-PCR method,named 4CL1.The results of multiple sequence alignment showed that 4CL1 was of 1 686 bp with 98%～100% nucleic acid sequence similarity and 99%～100% amino acid sequence similarity to the reported Arabidopsis thaliana 4-coumaryl: CoA ligase1.Domain analysis results revealed that the AMP-binding characteristics sequences of LPYSSGTTGLPKGVLFGPGLT and the active site sequences GEICIRG of 4-coumaryl:CoA ligase protein family were found in cloned 4CL1 amino acids sequence.The predicted molecular weight was 61.05 kDa and the theoretical isoelectric point was 5.25.The calculated instability parameter was 35.93,which indicated that this protein was stable in classification.The secondary structure of resveratrol synthase mainly contained random curling,α-helix,extended strand and β-turn,which content was 34.22%,30.30% ,24.06% and 17.66%,respectively.

Arabidopsis thaliana;4-coumaryl: CoA ligase;Gene clone;Sequence analysis

Q943.2

A

2096-0387（2017）03-0001-05

翟逸（1980-），男，博士，研究方向：微生物分子生物学与基因工程。