三四龄中华稻蝗消化道菌群分离及主要特性研究

王耀，徐军

（1.晋中职业技术学院，山西晋中030600；2.山西大学，山西太原030006）

三四龄中华稻蝗消化道菌群分离及主要特性研究

王耀，徐军

（1.晋中职业技术学院，山西晋中030600；2.山西大学，山西太原030006）

本文采用平板稀释分离、斜面纯化培养等方法，对三四龄的中华稻蝗消化道内菌群进行分离，并应用多种培养基对分离出的菌群做初步生理生化代谢试验。结果表明：其消化道内菌群以革兰氏阴性杆菌为多。这些菌种在体外氮源利用率很低，对无机碳源的利用率较有机碳源高；可产生纤维素酶的菌种较少；绝大多数菌种可发酵多种糖并产酸产气；明显有酵母菌存在，且其活力很强。

中华稻蝗；消化道微生物；同化碳（氮）源试验；糖发酵试验

中华稻蝗Oxya chinensist (Thunberg)，属直翅目、斑腿蝗科、稻蝗属[1]，是稻区土蝗中的优势种之一，国内分布几乎遍及所有稻区，国外分布于朝鲜、日本、马来西亚、菲律宾和斯里兰卡等国。该虫取食禾本科农作物、稗草、芦苇等杂草以及莎草科植物，尤喜食水稻叶片。中华稻蝗若虫孵化后，3龄前多在杂草上取食，以后迁移到田内危害水稻。

中华稻蝗的消化系统分为前肠、中肠和后肠[2]。前肠功能主要是取食、食物的机械研磨、贮存和初步消化。中肠分泌消化酶，对食物进行消化和吸收，常形成盲囊、腺体等进一步加强消化吸收。后肠可以对一些离子及水分重新吸收。消化系统是蝗虫赖以生存的最重要器官之一，消化道中的微生物数量和种类多十分庞杂，并构成了一个具有一定功能的微生态系统，该系统中微生物与微生物间、微生物与宿主间都存在着十分密切又复杂的关系，其对宿主的健康有着重要影响。对其的研究有利于观察昆虫共生微生物与宿主的相互作用。许多重要的农业或卫生昆虫是依靠共生微生物生长和繁殖的，利用某些微生物可达到以菌治虫的目的。

对中华稻蝗消化道的研究集中在显微解剖结构方面，如Wagan等[3]对蝗总科的前肠进行过研究；张小民等[4]对中华稻蝗全消化道内壁显微结构进行了观察研究。因消化道正常菌群绝大多数都是厌氧或兼性厌氧菌，很难用普通培养基直接培养出来，大多数菌种仅依靠传统的分离培养和生化鉴定是一项费时而繁琐的工作，故现阶段微生物菌群分离、鉴定的系统方法多在分子水平上，以微生物鉴定系统和PCR技术为主，对中华稻蝗消化道内菌群的分离及对其生理生化特性的研究报道甚少。本次试验完全采用微生物实验方法，对中华稻蝗消化道微生物进行初步的定性研究。

1 材料与方法

1.1 虫种

3龄和4龄的中华稻蝗，。

1.2 主要仪器

超净台、高压蒸气灭菌锅、电热恒温培养箱、冰箱和光学显微镜OLYMPUS BX41。剪刀、镊子、丝线、接种环、解剖针、涂布玻璃棒、pH试纸、培养基分装器、分析天平、药匙、量筒、试管、锥形瓶、烧杯、酒精灯、载玻片和盖玻片等。

1.3 主要试剂

孔雀绿、结晶紫、番红复染液、碘液、NaOH、5%乙醇、75%乙醇和5%硫代硫酸钠。消毒药水，泡腾片半片（有效氯含量=500mg/片，茂康牌）加100mL自来水，完全溶解后备用。无菌水，在121℃下灭菌20min备用。

1.4 培养基

营养琼脂（牛肉膏蛋白胨）培养基，马铃薯培养基（PDA），酵母菌子囊孢子形态观察用培养基——麦氏琼脂培养基[5]；同化碳源试验——无碳培养基，同化氮源试验——无氮培养基，糖、醇发酵培养基，纤维素水解试验——试管测试法[6]，酵母菌糖发酵培养基，酵母菌同化碳源培养基，马铃薯琼脂培养基，葡萄糖-酵母膏-蛋白胨液体培养基[7]。

1.5 虫体表面消毒方法

将中华稻蝗的口和肛门用丝线扎住，在无菌操作的条件下，浸入75%乙醇约1min，用镊子取出后转至无菌水中洗涤一遍，再浸入消毒药水中3～5min，转入5%硫代硫酸钠溶液中浸泡3～5min，取出后转至无菌水中，洗涤5遍。

1.6 制备消化道稀释液方法

表面消毒后的中华稻蝗，肛门部分用无菌剪刀剪去，将其消化道液挤入盛有9mL无菌冷却水并带有数粒玻璃珠的已灭菌的三角烧瓶中（稀释倍数10），振荡平摇约10min。无菌操作移取1mL菌悬液加入盛有9mL无菌水的试管中（稀释倍数102），吹吸3次，充分混匀；另取一无菌移液管从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中（稀释倍数103），吹吸3次，充分混匀；以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4不同稀释度的消化道菌悬液。

1.7 平板涂布方法

将上述的营养培养基和马铃薯培养基的平板底面分别用记号笔写上稀释度，然后无菌操作分别由对应的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌悬液滴在对应位置，做平板涂布。室温下静置5～10min，使菌液吸附进培养基。

营养培养基平板，稀释度为10-2、10-3、10-4的平板各3个，用于分离细菌；马铃薯培养基平板，稀释度为10-2、10-3、10-4的平板各3个，用于分离真菌。涂布好的平板全部放入28℃培养箱培养两三天。

1.8 菌落计数及菌种纯化

培养结束后，统计不同的培养基平板上相关类群的微生物菌落。

从不同的培养基平板上，选取菌种编号标记，记录其菌落形态，分别转接到相应的培养基斜面中，置于28℃培养箱进行纯化培养，备用。

1.9 细菌的革兰氏染色和形态观察

对选出的细菌分别做革兰氏染色，观察记录其染色结果和个体形态。

1.10 细菌的主要生理代谢试验

将纯化培养结束后的菌种各加入4～5mL无菌水做成菌悬液，用其分别做同化碳源、氮源试验、糖（醇）发酵试验、纤维素水解试验，记录试验结果。

1.11 同化碳（氮）源试验

倒无碳培养基平板并做好标记，待其冷却后，在背面辐射状平均分成六格，标号。拿一支灭过菌的1mL移液管，将某一菌种的菌悬液取0.2mL滴在平板上，均匀涂布后，再用接种环将各种碳源取约小米粒大小的量放在编号相对应的位置，依次放好几种碳源之后，将平板倒置，放入28℃培养箱，培养3～7d后取出观察，记录结果。同化氮源方法相同。

本次试验所用碳源依次为葡萄糖、蔗糖、α乳糖、D+木糖（五碳糖）、甘露醇和可溶性淀粉。氮源依次为硫酸铵、硝酸铵、尿素、蛋白胨。

1.12 糖（醇）发酵试验

无菌操作下，用接种环挑取少许纯化的菌种放入糖（醇）发酵试验用液体培养基中，放入28℃培养箱，培养2～4d后取出观察，记录结果。此次试验所用糖类分别为葡萄糖、蔗糖、α乳糖、D半乳糖、D果糖、D+棉子糖和D+木糖。

1.13 纤维素水解试验

无菌操作下，用接种环挑取少许纯化的菌种放入纤维素水解试验用液体培养基中，放入28℃培养箱，培养4周后取出观察，记录结果。

1.14 酵母菌主要特性试验

酵母菌糖发酵试验、酵母菌同化碳源试验方法如糖（醇）发酵试验。试验所用糖类分别为葡萄糖、蔗糖、α乳糖、D半乳糖、可溶性淀粉和甘露醇。

酵母菌子囊孢子形态观察试验是将酵母菌转借到麦氏培养基后，培养3～5d，用接种环挑取稍许做常规涂片，酵母菌子囊孢子专用染色后镜检，拍照纪录。

酵母菌假菌丝观察试验用培养基倒平板，用接种环挑取菌种在其上平行的划几条线，并在线上覆盖一灭过菌的盖玻片。28℃培养2～4d后取出镜检，拍照。

酵母菌细胞形态观察试验方法如糖（醇）发酵试验。28℃培养2～4d后取出观察，记录结果。挑取少许菌悬液做常规涂片，1%美兰染色后镜检，拍照。

2 结果分析

2.1 平板稀释分离菌落计数结果

3龄虫平板稀释分离菌落计数结果见表1，4龄虫平板稀释分离菌落计数结果见表2。

表1 3龄虫平板稀释分离菌落计数结果

表2 4龄虫平板稀释分离菌落计数结果

由表1、2可知，随着菌液浓度从高到低，菌落数量由多到少变化。总体而言，马铃薯平板上的菌落数量少于营养平板上的。

2.2 分离纯化菌株的革兰氏染色显微观察结果

分离纯化菌株的革兰氏染色显微观察结果见表3。由表3可以看出，分离出的细菌种类较少，菌种基本以革兰氏阴性的杆菌为多，球菌为少，也有芽孢的菌种；偶见有酵母菌，其活力较强。

2.3 同化碳源、氮源利用结果

同化碳源、氮源利用结果见表4。由表4可知，分离出的细菌菌种在体外对氮源，无论无机还是有机氮源的利用率都很低。对无机碳源的利用率较有机碳源为高，尤其表现在对α-乳糖的利用上。值得注意的是，木糖是一种五碳糖。

2.4 糖发酵试验结果

糖发酵试验结果见表5。由表5可知，绝大多数分离得到的细菌菌种可发酵多种糖，产酸产气。其中，D+木糖是一种五碳糖，D+棉子糖是一种三糖，对其的发酵能力显然较弱，只有少数菌种可发酵产酸产气，大多数都不能分解这种糖。对α-乳糖的发酵能力偏弱，但此与碳源利用试验所得结果不太一致，初步推测是较长时间后菌种活力降低所致。

表3 分离纯化菌株的革兰氏染色及显微观察结果

2.5 纤维素试验结果

除ZHY三-6、ZHY三-11、ZHT三-10（酵母菌）可看到在滤纸上生长外，其余各菌种所在滤纸皆无明显变化。

2.6 酵母菌试验结果

酵母菌发酵试验结果见表6，酵母菌碳源同化试验结果见表7和图1～4。酵母菌斜面培养结果见图1，酵母菌ZHT三-10平板划线结果见图2，酵母菌ZHT三-10细胞形态观察结果见图3，酵母菌ZHT三-10子囊孢子观察结果见图4。

表6 酵母菌糖发酵试验

由表6可知，此酵母菌显然能利用大多数的糖类，但没发现能被其发酵产酸产气的糖类。图1、2为酵母菌形态照片，可清楚地看到其菌落形态。

表4 同化碳、氮源试验结果

表5 糖发酵试验结果

图1 酵母菌斜面培养结果（菌种呈粉红色）

图2 酵母菌ZHT三-10平板划线结果

从图3可以清楚地看到酵母菌的个体形态及其出芽生殖；图4只能看到酵母菌菌体，看不到绿色的子囊孢子，据此初步推测次酵母菌不产子囊孢子。

图4 酵母菌ZHT三-10子囊孢子观察

酵母菌的假菌丝观察时没有发现假菌丝，故认为此菌种不是假菌丝属。

3 结论

本试验对中华稻蝗消化道内菌群做了初步性研究，对中华稻蝗三龄、四龄虫消化道的菌群做出了较完整的分离，并对其主要生理生化反应进行了多种类的研究，得到了较明显的实验结果，但相较于3龄的虫体，4龄虫显然缺乏多样性，推测可能由于4龄虫消化道内的菌群对环境的适应性提高，优势种群生长旺盛所致。

本试验提出了分离消化道菌群的切实可行的操作过程，建立了其内部菌群主要特性研究的较简便、直观的试验方法，可为往后的同类试验提供一些基础性参照。

[1]吴海花,杨美玲,郭亚平,等.中华稻蝗若虫不同龄期酯酶的特性[J].昆虫知识,2006,43(3):336.

[2]许崇任,程红.动物生物学[M].北京:高等教育出版社,2003.

[3]MS Wagan.Anatomy and histology of the alimentary canal of Chrotogonus trachypterus (Blanchard)[J].Pakistan Journal of Zoology,1986,18(4):411-416.

[4]张小民,郭亚平,许晶,等.中华稻蝗全消化道内壁显微结构观察[J].昆虫学报,2006,49(2):219-229.

[5]沈萍,范秀容,李光武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,2004.

[6]赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2002.

[7]中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌[M].北京:科学出版社,1978.

Study on Isolation and Main Characteristics of Digestive Tract Bacteria of Three or Four Year Old Oxya chinensist

Wang Yao,Xu Jun
(1.Jinzhong Vocational &Technical College,Shanxi Jinzhong 030600;2.Shanxi University,Shanxi Taiyuan 030006)

In this paper,by using the method of plate dilution separation,slant surface purification and culture,digestive tract bacteria of three or four age old Oxya chinensist were isolated,and the physiological and biochemical metabolic tests were carried out by using various media.The results showed that the bacteria in the digestive tract were gram negative bacilli.These strains in vitro nitrogen utilization rate was low,utilization of inorganic carbon source was the organic carbon source;Less bacteria could produce cellulase;The vast majority of bacteria could ferment a variety of sugar and acid production gas;Yeast obviously exist,and its vitality was very strong.

Oxya chinensist;Digestive tract microorganism;Assimilation carbon (nitrogen) source test;Sugar fermentation test

Q966

A

2096-0387（2017）03-0056-06

王耀（1984-），女，山西晋中人，硕士，助教，研究方向：生物学。