天然超富硒酵母XS-1发酵营养成分研究

陈菲菲，姚文华*，李红英

(1.湖北省恩施州农科院，湖北恩施445000；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北恩施445000)

天然超富硒酵母XS-1发酵营养成分研究

陈菲菲1，2，姚文华1，2*，李红英1，2

(1.湖北省恩施州农科院，湖北恩施445000；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北恩施445000)

为获得有较高硒含量以及得率较高的XS-1的培养基配方，通过单因素实验及正交实验，优化实验室已有天然超富硒酵母XS-1的培养基成分。结果表明，XS-1的最佳培养基配比为：蔗糖的总添加量为10%，牛肉膏与酵母膏的添加比例为2∶3，牛肉膏与酵母膏的总添加量为4%，MgSO4·7H2O的总添加量为0.05%。优化后的培养基更有利于酵母XS-1的生长。

酵母；培养基；优化；硒

已有研究证明，硒与健康息息相关[1-4]。硒是动植物生长不可或缺的微量元素，亦是人体内多种功能酶的活性中心，如谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）家族[5]、脱碘酶（ⅠD）家族[6]等，这些酶在机体抗氧化及免疫力等方面发挥着重要的作用。但大量研究表明，无机硒毒性强且吸收低，而有机硒则较为安全[7]，已成为替代亚硒酸钠的有机硒源[8，9]。近年来，有机硒作为补硒添加剂已在食品和医药等领域得到了较为广泛的应用。

目前，有机硒的获得途径主要是富硒酵母的培养[10]，且富硒酵母是整个硒产业的顶端产物。富硒酵母是当前能够通过工业途径得到的硒含量稳定且有机硒含量能够达到现有标准的有机硒原料。同时，其产量能够得到保证，能够满足一部分人群长期补硒的需求。

近年来，通过酵母的生物富集功能，将无机态硒转化为有机态硒的理论及相关研究已有很多报道[11]。酵母具有较高的硒富集及硒转化能力，在酵母细胞内，硒元素能够取代部分含硫氨基酸中的硫元素，即生成硒代氨基酸，并进一步得到相应的蛋白质，将无机形式的硒元素转化为有机形式的硒，因此，富硒酵母已成为有机硒研究的热点[12-14]。

本文针对本实验室已有天然超富硒酵母XS-1，研究其生长过程，优化培养基条件，即不同碳源、氮源、无机盐及促生长因子对该酵母富硒发酵的影响，通过单因素实验和正交实验分析优化富硒发酵培养基条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天然超富硒酵母XS-1，实验室自筛菌。

酵母膏、硝酸铵、硫酸铵、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘油、甘露醇、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和亚硒酸钠（分析纯）。

肉汤培养基：1%牛肉膏、1%蛋白胨、6%蔗糖、0.15%硫酸氢二钾[15]。

1.2 仪器与设备

恒温振荡培养箱、高压灭菌锅、超菌工作台、鼓风恒温烘箱。

1.3 实验方法

1.3.1 XS-1生长曲线的测定

利用肉汤培养基，接种现已保存的XS-1菌种，每2h取样测定其吸光值（OD值），测得其生长曲线。

1.3.2 XS-1种液的制备

利用肉汤培养基，接种现已保存的XS-1菌种，发酵至对数期即可按10%的比例接种至新的培养基进行发酵。

1.3.3 XS-1培养基碳源的优化

碳源主要选用蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘油和甘露醇6种糖作为碳源，添加量为6%，其余成分与发酵培养基相同。离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

根据结果选用最佳碳源，进行2%、4%、6%、8%和10%的梯度试验。其余成分与发酵培养基相同。离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

1.3.4 XS-1培养基氮源的优化

氮源主要选用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸铵、硫酸铵作为氮源，添加量为2%，同时考察蛋白胨与牛肉膏（1∶1）、牛肉膏与酵母膏（1∶1）和蛋白胨与酵母膏（1∶1）3个复合氮源，总添加量为2%，其余成分与发酵培养基相同。离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

根据结果选用最佳碳源，进行1%、2%、3%、4%和5%的梯度试验。其余成分与发酵培养基相同。离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

若复合氮源结果为最优，需进行内部比例实验，2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2。其余成分与发酵培养基相同。离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

1.3.5 XS-1培养基无机盐的优化

无机盐主要选用MgSO4·7H2O、CaCl2、K2HPO4，添加量为0.15%，其余成分与发酵培养基相同。离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

根据结果选用最佳无机盐，进行0.05%、0.15%、0.25%、0.35%和0.45%的梯度试验。其余成分与发酵培养基相同。离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

1.3.6 XS-1培养基正交试验

在单因素实验的基础上，确定了发酵培养基中各组分及其适宜的使用量。考察的因素有碳源添加量、氮源添加量、复合氮源添加比例、无机盐添加量。借助正交设计助手软件，根据表1、2，采用L9（34）正交表进行试验，离心发酵液，用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，65℃烘干至恒重。

表1 各成分添加量

表2 各实验组培养基配比

1.3.7 XS-1发酵培养基硒添加量的优化

利用最优培养基发酵，硒添加量为500、1 000、1 500、2 000mg/kg和2 500mg/kg。

1.4 总硒的测定

收集干燥后的菌体，根据国家标准GB5009.93-2010测定总硒。

1.5 数据处理

根据收集干燥后的菌体重量的数据，应用下列公式计算生物量：生物量（mg/kg）=（M1/M2）×1 000。其中：M1为干燥后的菌体重量，g；M2为发酵结束后发酵液的总质量，kg。

2 结果与分析

2.1 XS-1生长曲线的测定

利用肉汤培养基，接种XS-1菌种，每发酵2h取样测定其OD值，测定其生长曲线如图1所示。

图1 XS-1生长曲线

由图1曲线可见，0～12h为适应期，12～20h为对数期，20～44h均为稳定期，本实验未测量XS-1的衰亡期。

2.2 XS-1种液的制备

根据图1，种液发酵到12小时后，每两个小时取样测其吸光度，吸光度为1.0-1.8，则种液符合要求。

2.3 XS-1培养基碳源的优化

改变不同的培养基，接种XS-1菌种，测定其生物量和总硒量如图2所示。

图2 不同碳源对XS-1的影响

由图2可知，碳源为葡萄糖或蔗糖时，生物量及总硒量均显著高于其他碳源组，葡萄糖实验组与蔗糖实验组相比，差异不明显。蔗糖实验组生物量及总硒量略高于葡萄糖实验组，因此，蔗糖为最优碳源。

不同蔗糖添加量对XS-1的生物量影响实验结果如图3所示。

图3 不同蔗糖添加量对XS-1的影响

由图3可看出，不同蔗糖添加量对XS-1的生物量影响不显著，蔗糖添加量为8%或10%时，总硒量显著高于其他实验组。蔗糖添加量为8%的实验组与蔗糖添加量为10%的实验组相比，差异不显著。蔗糖添加量为8%的实验组的生物量及总硒量略高于蔗糖添加量为10%的实验组，因此，蔗糖的最适添加量为8%。

2.4 XS-1培养基氮源的优化

培养基不同氮源的优化实验结果如图4所示。

图4 不同氮源对XS-1的影响

由图4可得，氮源为牛肉膏与酵母膏（1%∶1%）或蛋白胨与酵母膏（1%∶1%）时，生物量略高于其他氮源组，氮源为牛肉膏与酵母膏（1%∶1%）或蛋白胨与牛肉膏（1%∶1%）时，总硒量显著高于其他氮源组。因此，综合考虑，牛肉膏与酵母膏为最优氮源。

不同牛肉膏与酵母膏（1∶1）添加总量对XS-1的影响实验结果如图5所示。

图5 不同牛肉膏与酵母膏（1∶1）添加总量对XS-1的影响

由图5可得，牛肉膏与酵母膏（1∶1）添加量为4%的实验组，总硒量显著高于其他实验组，生物量略高于其他实验组，因此，牛肉膏与酵母膏（1∶1）的最适添加总量为4%。

实验不同牛肉膏与酵母膏添加比例对XS-1的影响，结果如图6所示。

由图6可知，牛肉膏与酵母膏的添加比例为2∶1、3∶2、2∶3时，生物量显著高于其他实验组，牛肉膏与酵母膏的添加比例为2∶3时，总硒量显著高于其他实验组。因此，综合考虑，牛肉膏与酵母膏的最优添加比例为2∶3。

2.5 XS-1培养基无机盐的优化

XS-1培养基无机盐的优化实验结果如图7所示。

图7 不同无机盐对XS-1的影响

由图7可得，3种无机盐实验组，生物量差异不显著，无机盐为MgSO4•7H2O时，总硒量显著高于其他两种无机盐实验组，因此，MgSO4•7H2O为最优无机盐。

实验不同MgSO4·7H2O添加量对XS-1的影响，结果如图8所示。

图8 不同MgSO4·7H2O添加量对XS-1的影响

由图8可知，MgSO4•7H2O添加量为0.45%的实验组与其他实验组相比，生物量显著低于其他实验组，其他实验组的生物量差异不显著，MgSO4•7H2O添加量为0.15%的实验组，其生物量及总硒量略高于其他实验组。因此，MgSO4•7H2O的最适添加量为0.15%。

2.6 XS-1培养基正交试验

在单因素实验的基础上，进行正交设计优化实验，采用L9（34）正交设计，按表1、2，实验优化，结果如图9所示。

图9 XS-1的培养基成分正交试验的结果

由图9可知，第5组的生物量于总硒量显著高于其他组。因此，XS-1的优化培养基配比为：蔗糖的总添加量为10%，牛肉膏与酵母膏的添加比例为2∶3，牛肉膏与酵母膏的总添加量为4%，MgSO4•7H2O的总添加量为0.05%。

3 结论

本实验针对本实验室已有天然超富硒酵母XS-1，研究其生长曲线，优化培养基条件，即不同碳源、氮源、无机盐以及促生长因子对该酵母富硒发酵的影响，以期能得到有较高硒含量以及得率较高的XS-1的培养基配方，即最大限度地利用现有的这种天然聚硒酵母。

通过单因素试验得知，蔗糖为最优碳源，牛肉膏与酵母膏为最优氮源，MgSO4·7H2O为最优无机盐。同时，蔗糖的最适添加量为8%，牛肉膏与酵母膏（1∶1）的最适添加总量为4%，牛肉膏与酵母膏的最优添加比例为2∶3，MgSO4·7H2O的最适添加量为0.15%。但这并不代表这些条件的叠加就是最优的培养基配方，因此，根据单因素试验的结果，需要再利用正交实验来确定最终的最优培养基配方。

综上所述，本实验最终得到XS-1的最佳培养基配比为：蔗糖的总添加量为10%，牛肉膏与酵母膏的添加比例为2∶3，牛肉膏与酵母膏的总添加量为4%，MgSO4·7H2O的总添加量为0.05%。

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Study on the Nutrient Component of the Selenium Yeast Chen Fei-fei1,2,Yao Wen-hua1,2*，Li Hong-ying1,2

(1.Agricultural Sciences Academy of Enshi in Hubei Province,Hubei Enshi 445000;2.Enshi Qingjiang Bio-Engineering Co.,Ltd.,Hubei Enshi 445000)

To obtain a culture medium with a higher selenium content and a higher yield of XS-1,the single-factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the culture medium of natural super selenium enriched yeast XS-1.The results showed that the optimum medium ratio of XS-1 was 10% sucrose,the proportion of extractum carnis and yeast extract was 2∶3,the total amount of extractum carnis and yeast extract was 4%,the amount of MgSO4·7H2O was 0.05%.The optimized medium is more favorable for the growth of yeast XS-1.

Yeast;Culture medium;Optimization;Selenium

TQ920.1

A

2096-0387（2017）03-0018-05

湖北省科技支撑计划资助项目（2013BEC048）。

陈菲菲（1988-），女，湖北恩施人，硕士，工程师，研究方向：食品微生物。

姚文华（1968-），女，湖北天门人，本科，副高级农艺师，研究方向：食品微生物。