松针中游离氨基酸代谢对环境氮的响应

胡居吾，朱仁果*，王慧宾，邓朝阳，张蕾

（1.江西省科学院应用化学研究所，江西南昌330096；2.山西省实验中学，山西太原030200）

松针中游离氨基酸代谢对环境氮的响应

胡居吾1，朱仁果1*，王慧宾1，邓朝阳1，张蕾2

（1.江西省科学院应用化学研究所，江西南昌330096；2.山西省实验中学，山西太原030200）

通过分析贵州省贵阳市区雪松松针组织中总游离氨基酸含量和氨基酸单体含量变化，发现贵阳市雪松针叶组织的总游离氨基酸含量从贵阳市远郊到交通主干道呈上升趋势，从远郊的484.5μg/g增加到交通主干道的2 449.6μg/g，该变化趋势与总氮变化一致，但针叶中总游离氨基酸含量的变化范围（增加了5.1倍）要大于针叶中总氮含量变化范围（增加了1.6倍）。该结果表明松针中的游离氨基酸也能用于指示环境氮含量的变化，且对环境氮的响应比植物总氮更灵敏。贵阳市区雪松针叶中20种游离氨基酸的含量都随着组织总氮含量的增加而增加。其中，以脯氨酸（Pro）和赖氨酸（Lys）含量的增加最为显著，分别增加了25倍和30倍。当组织总氮增加时，每种氨基酸占总氨基酸的比例会发生变化。其中，脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）增加的比例最多，Pro占总游离氨基酸的比例从3%增加15%，Arg占总游离氨基酸的比例从8%增加13%；而谷氨酸（Glu）占总氨基酸的比例减少最多从37%下降到23%，表明环境氮含量增加时，多余的含氮会通过合成特定的低C/N比游离氨基酸来消解。

环境氮；松针；贵阳市

近年来增加的氮沉降使得一些原本氮缺乏的生态系统有着过多的氮供给。当氮沉降超过了生态系统氮的保留能力时将会导致氮饱和。氮饱和会给植物带来一系列的影响，比如矿物的不平衡（必须矿物Mg、K、P相对于N的缺乏）[1]，针叶发黄[2]，菌根数量减少[3]，甚至会使得森林退化和生物多样性减少[4]。

在过量氮沉降引起某种植物种类和数量大量变化之前，植物自身的新陈代谢会对高的氮输入作出响应，如叶子氮浓度的增加[4，5]和游离氨基酸的累积[3]。这些植物组织内新陈代谢的变化可以用于指示该植物种、采样点或是生态系统是否受到了过量氮沉降的影响。

已有研究表明植物叶片中的含氮化合物（非蛋白氮和溶解性氨基酸）可以用于指示植物组织中早期的氮积累[3]。对松针[6]、森林下层林木[7]、欧石楠植物[5]、侧生萌苔藓组织[8]中游离氨基酸的研究，都发现了植物组织中游离氨基酸对大气氮沉降的响应。但是，目前对植物中特定游离氨基酸单体对环境氮响应的研究还较少。

本研究通过分析贵州省贵阳市区雪松松针组织中游离氨基酸含量的变化，揭示环境氮沉降变化对植物氨基酸代谢可能产生的影响，探讨特定氨基酸对环境氮的响应差异，以及利用游离氨基酸含量变化示踪环境氮含量变化的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究区域状况

贵州省贵阳市是我国西南喀斯特地区的一个省会城市。贵阳市大气氮沉降的主要特征是氨浓度高，氮氧化物的浓度较低。随着经济的发展，贵阳市氮氧化物的排放量呈上升趋势，见表1。从表1可见，2011年氮氧化物排放总量为55.32万t，比2010年增加12.24%。

表1 贵州省贵阳市近年来氮氧化物的排放量

1.2 试样的采集和处理方法

于2012年3月在贵阳市远郊、公园、市中心和交通干道采集雪松样品。采样点开阔不受建筑物等遮挡。所有采集的松树没有明显损伤。松针枝条位于树的北面或是东北面以避免可能的光照对氨基酸浓度的影响。所有样品用干净塑料自封袋保存，迅速放入冰盒，带回实验室冰箱-20℃冷冻保存备用。

1.3 实验仪器

ST16高速离心机，美国Thermo公司；Essential 5 Millipore纯水机，美国Millipore公司；BS210S分析天平，德国Sartorius公司；SL-200小型万能粉碎机，杭州三思仪器公司；PHS-2C数显恒温水浴锅，江苏金坛市医疗器械；Agilent 6890气相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.4 游离氨基酸的提取和测定方法

将采集样品冷冻干燥后，准确称取200mg样品。用10mL 90℃超纯水提取30min，待冷却后离心（1万转；45min）取上清液过0.22μm滤膜，再用10mL超纯水超声波复提30min后离心（1万转；45min），取上清液过0.22μm滤膜。将2次过滤后的上清液混合于-20℃条件下保存。

游离氨基酸含量的测定参照Jiménez-Martín（2012）的方法[9]。用硅烷化衍生方法（MTBSTFA）将19种蛋白质氨基酸和1种非蛋白质氨基酸（GABA）衍生成其相对应的N（O）-叔丁基二甲基硅烷氨基酸衍生物后用气相色谱（Agilent 6890，美国）测定氨基酸含量。分析时的测试条件是：色谱柱为DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；载气为氦气；恒流模式为流速1.2mL/min；进样口温度270℃；采用三阶段程序：90℃保留1min，8℃/min升到140℃，保留5min，3℃/min升到220℃，12℃/min升到285℃保持12.5min。

2 结果与讨论

2.1 不同氮沉降下针叶中总游离氨基酸含量变化

本文分析了贵阳市4个采样点雪松针叶中总游离氨基酸的变化以及占总氮的比例，结果如图1所示。

图1 贵州省贵阳市雪松针叶总氨基酸含量和总氮含量的变化

从图1可见，贵阳市雪松针叶组织的总氮含量从贵阳市远郊到交通主干道增加，变化范围为1.6%～2.7%。相应的针叶组织中的总游离氨酸含量也呈上升趋势，从郊区的484.5μg/g增加到交通主干道的2 449.6μg/g。针叶中总游离氨基酸含量的变化（增加了5.1倍）要大于针叶中总氮含量变化（增加了1.6倍）。

2.2 不同氮沉降下针叶中总游离氨基酸占总氮的比例变化

通过分析市区4个采样点雪松针叶中游离氨基酸占总氮的比例发现，随着雪松针叶中总氮含量增加，针叶组织中游离氨基酸会也相应增加，并且当组织总氮到达某一阈值时，针叶中游离氨基酸会发生显著的累积。郊区雪松针叶组织中总游离氨基酸含量占总氮含量的2.7%，而在市区交通主干道上这个比例上升到了9.8%。雪松针叶的总氮含量增加小于19mg/g时，总游离氨基酸占总氮的百分比变化不大，占松针总氮的比例小于3.5%。当雪松针叶中的总氮含量大于19mg/g时，总游离氨基酸占总氮的百分比明显增大，占总氮的比例大于7%（见图2）。

图2 贵阳市总氨基酸占总氮含量的百分比

2.3 雪松针叶中20种游离氨基酸含量分析

贵阳市区雪松针叶中20种游离氨基酸的含量都随着组织总氮含量的增加而增加。其中，以脯氨酸（Pro）和赖氨酸（Lys）含量的增加最为显著，分别增加了25倍和30倍。其他含量显著增加的氨基酸还有异亮氨酸（Ⅰle）、天冬酰胺（Asn）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）。松针中Ⅰle、Asn含量增加了9倍，Arg含量增加了8倍，His含量增加了6倍（见图3）。

图3 市区松针组织中20种氨基酸含量

2.4 雪松针叶中20种游离氨基酸占总氨基酸含量比例变化

雪松针叶组织总氮含量增加时，20种游离氨基酸增加幅度并不相同，当组织总氮增加时，每种氨基酸占总氨基酸的比例会发生变化。丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ⅰle）、脯氨酸（Pro）、丝氨酸（Ser）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）和色氨酸（Trp）占总游离氨基酸比例增加，甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）和酪氨酸（Tyr）占游离氨基酸比例减少。其中，Pro、Arg增加的比例最多，Pro占总游离氨基酸的比例从3%增加15%，Arg占总游离氨基酸的比例从8%增加13%；而Glu占总氨基酸的比例减少最多，从37%下降至23%（见图4）。

图4 20种氨基酸游离氨基酸占总氨基酸含量的比例

3 结论

贵阳市从远郊到交通主干道松针组织中总游离氨基酸含量和总氮含量也有相似的变化规律，并且总游离氨基酸含量的变化范围要大于植物总氮的变化，说明松针中的游离氨基酸对环境氮的响应比植物总氮更灵敏。

环境氮含量会改变植物的氮代谢机制，多余的含氮化合物会通过合成低的C/N比游离氨基酸来解毒。可以通过测定特定氨基酸含量变化来指示环境氮沉降。

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Free Amino Acids in Pine Needles Response to Environment Nitrogen

Hu Ju-wu1，Zhu Ren-guo1*，Wang Hui-bin1，Deng Zhao-yang1，Zhang lei2
(1.Institute of Applied Chemistry,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330029;2.Shanxi Experimental Secondary School,Shanxi Taiyuan 030200)

Total nitrogen content of cedar needles tissues increased from rural of Guiyang city of Guizhou province to the main traffic road ,corresponding total free amino acid content in the needles showed the same ascendant trend,increased from 484.5μg/g in the suburbs of Guiyang to 2 449.6 μg/g in traffic trunk road.Change trend of free amino acids content in needle was consistent with total nitrogen,and the changes of the content of free amino acid (5.1) were greater than the total nitrogen of needle tissues (1.6).The response of the free amino acid of needles to environment nitrogen was more sensitive than total nitrogen of the needle tissues.The content of twenty kinds of free amino acids of cedar pine increased by the total content of nitrogen of cedar pine in Guiyang city,but increased proportion of Twenty amino acids was different,which finally result proportion of amino acids in needle changed.Pro and Arg increased most significantly.Pro increased from 3% to 15%.Arg increased from 8% to 13%.Glu decreased from 37% to 23%.Higher doses of nitrogen or long term impacts in pine stands lead to changes in the detoxification mechanism.In order to avoid an accumulation of cytotoxic ammonia,assimilated nitrogen compounds must be detoxified by forming amino acids with available C-skeletons.

Environmental nitrogen;Pine needles;Guiyang City

X173

A

2096-0387（2017）03-0005-04

江西省自然科学基金（2014FBAB203021）。

胡居吾（1977-），男，博士在读，副研究员，研究方向：天然产物化学。

朱仁果（1985-），博士，研究方向：天然产物化学。