葛根酒中葛根素含量测定及其抗氧化性能研究

徐国良，黄燕，涂招秀,李雄辉，胡居吾

（江西省科学院，江西南昌330096）

葛根酒中葛根素含量测定及其抗氧化性能研究

徐国良，黄燕，涂招秀,李雄辉，胡居吾

（江西省科学院，江西南昌330096）

采用SYKAM S501 Series液相色谱仪，Shimadzu Shim-pack VP-ODS C18色谱柱（5μm，4.6mm×250mm），甲醇∶水=35∶65为流动相，检测波长为250nm，快速测定葛根酒中葛根素含量，并通过超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·）清除率测定法评价葛根酒体外抗氧化活性。结果表明，葛根酒中葛根素的含量为160.83μg/mL。其对1，1-二苯基-2-苯基自由基的清除率达到53.1%，对羟基自由基的清除率 达到35.67%，对超氧阴离子自由基的清除率达到75.36%。这说明葛根酒中含有较多的葛根素，具有较强的体外抗氧化活性，并具有一定的保健作用。

葛根酒；葛根素；高效液相；抗氧化活性

葛根为多年生豆科藤本植物，原产于东南亚地区，如中国、韩国和日本。药用价值高，国人称之为“南方人参”，国际上誉称“亚洲人参”。传统上一直用于治疗急性腹泻、痢疾、耳聋与心血管等疾病[1，2]，在中国南方及美国北部葛根被用作煲汤资源及膳食补充剂[3]。2000年，葛根和粉葛被收入中国药典，统称为葛根，由于其主要成分葛根素含量的不同，直到2005年中国药典修订版才将二者分开，即为葛根和粉葛。葛根主要有效活性成分有异黄酮、葛根素、葛根苷、生物碱等物质[2，4]，富含铁、钙、硒、锗和锰等人体必需的微量元素。葛根及其制品有清火、排毒、降血压、降胆固醇、降血糖、减肥和通便，预防老年性痴呆，防止动脉硬化，防止脑血栓等心脑血管疾病之良效。我国卫生部2002年正式公布葛根为“药食同源”植物，可用于功能性保健食品及新药的研发[1，5]。

目前在葛根酒的研究中多添加糯米、玉米和粳米，以根霉或黑曲霉类为主要发酵剂酿制葛根黄酒[6-8]，而以纯葛根为原料，酿造低度发酵酒方面的相关研究只有零星报道[9]。本研究以葛根作为酿酒原料，利用淀粉酶和糖化酶快速糖化葛根淀粉，葡萄酒酵母和木糖酵母混合发酵，在较短的时间内酿制具有葛根风味的低度发酵酒，以葛根酒为考察对象，采用RP-HPLC法建立测定其中葛根素含量的方法，并测定抗氧化活性，可为葛根保健酒质量品质控制提供精确的含量检测方法，并为葛根中药材现代深加工中的应用提供参考依据。

1 实验材料

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

葛根采自于江西省东乡县，葛根酒由江西省科学院应用化学研究所酿制。

1.1.2 试剂

葛根素标准物质（96.0%，中国食品药品检定研究院），二苯基苦味酰基苯肼（DPPH）购于Sigma公司。抗坏血酸、邻苯三酚、无水乙醇、过氧化氢、七水硫酸亚铁、水杨酸、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯化铁、氢氧化钠和浓硫酸等试剂均为分析纯，色谱甲醇均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

SYKAM S501 Series高效液相色谱仪；S-3250紫外检测器；S-4115柱温箱；S-5300自动进样器；S-1130四元泵；SYKAM色谱工作站；分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；Tecan infinite M200PRO酶标仪，瑞士Tecan公司；Direct-Q3 CHAO超纯水系统，美国密理博公司；微孔溶剂过滤器，天津津腾过滤器件厂；津腾微孔过滤膜（直径50mm，孔径0.45μm）。

1.3 实验方法

1.3.1 葛根素标准曲线

用精度为万分之一的电子天平精密称定葛根素对照品44mg，将该对照品溶解后用35%甲醇溶液定容于10mL容量瓶中，制得4.4mg/mL葛根素对照品溶液，以此液为母液，分别精密移取，制备梯度浓度对照品，则葛根素对照品浓度分别为880、440、220、110μg/mL和55μg/mL。以浓度（X）对峰面积（Y）作图绘制标准曲线。

1.3.2 色谱条件

色谱柱Shimadzu Shim-pack VP-ODSC18色谱柱（5μm，4.6mm×250mm），甲醇∶水=35∶65为流动相，检测波长为250nm，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。

1.3.3 葛根酒中葛根素样品测定

吸取自制葛根酒1mL，过微孔滤膜，进样量为10μL，注入高效液相色谱议。

1.3.4 DPPH·清除率的测定

按照Hu[10]方法稍作修改，取葛根酒及维生素C（浓度为100μg/mL）100μL加到96孔透明板中，分别加入100μL 0.2mM的DPPH溶液。依照相同的操作方法，将葛根酒样品液分别与80%甲醇混匀作为空白组，采用酶标仪在波长517nm处测其吸光值，重复3次实验，每次3组平行，取平均值。DPPH·清除率的计算公式如下：DPPH清除率/%=[1-（Asample-Ablank）/Acontrol]×100%。其中，Asample为DPPH溶液与样品液的吸光度之和，Ablank为样品与溶剂的吸光度之和，Acontrol为DPPH溶液与溶剂的吸光度之和。

1.3.5 羟基自由基清除率的测定

参照文献[11]的方法进行改良，利用H2O2和FeSO4混合发生Fenton反应，生成具有高反应活性的·OH，以抗坏血酸作阳性对照，在96孔板中依次加入6mmol/L FeSO4溶液50μL、葛根酒溶液50μL，6mmol/L H2O2溶液50μL，摇匀，静置10min，再加入6mmol/L水杨酸溶液50μL，摇匀，水浴37℃保温30min采用酶标仪在波长510nm处测其吸光值，重复3次实验，每次3组平行，取平均值。测得样品吸光度为Ai；用水代替水杨酸时测得本底Aj，用水代替样品时测得空白对照A0。·OH自由基清除率的计算公式如下：·OH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。

1.3.6 对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用

实验在参考罗秋水等[12]的方法上进行改良。采用邻苯三酚自氧化法测定对·的清除作用，具体步骤是：在离心管中依次加入0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）450μL，25℃恒温水浴20min，分别加入50μL试样和40μL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴反应5min，加入8mmol/L HCl终止反应，于波长299nm处测定吸光度Ai。空白对照组以同样体积的蒸馏水代替样品（A0）。每个试样做3个平行样，取平均值。超氧阴离子自由基清除率计算公式如下：·清除率/%=[（A0-Ai）/Ao]×100%。

2 结果与讨论

2.1 葛根酒中葛根素的含量

依照上述色谱条件依次注入液相色谱仪，以峰面积积分值Y为纵坐标，以标品葛根素的浓度值X为横坐标，绘制标准曲线，得葛根素的线性回归方程Y=48.864X+611.05，R2=0.999 7。标准曲线图见图1，葛根素对照品色谱图如图2所示。

图1 葛根素标准曲线

图2 葛根素标品（A）和葛根酒样品（B）色谱图

根据所得葛根酒样品峰面积，代入标准方程，所得葛根酒中葛根素含量为160.83μg/mL。王明强等[13]报道云南省沾益福上福葛根酒业有限公司生产的葛根酒中葛根素含量，葛根酒A中葛根素的含量为1.0mg/100mL，葛根酒B中葛根素的含量为1.5mg/100mL，葛根酒C中葛根素含量为1.3mg/100mL，葛根酒D中葛根素的含量为0.79mg/100mL。而本课题酿制的葛根酒中葛根素的含量为16.083mg/100mL，高出15倍之多，这可能与葛根原料和酿造工艺不同所引起的。广东蕉岭县浒竹酒厂酿制的“中葛008”葛根酒葛根素含量为15.4mg/100mL，其原料以葛根、葛花为主料，并与富含生物色素的桑果、黑豆、有机蜂蜜等黑色食品为配料[1]。严格意义上说，本课题研制的葛根酒含量略高于“中葛008”葛根酒。

2.2 抗氧化能力

清除DPPH自由基是一种用途最为广泛的抗氧化模型，由于其快捷、高效、稳定的特点常被用来检测各种样品的清除自由基的能力。由图3可知，维生素C浓度为100μg，葛根酒对DPPH自由基的清除率为53.10%，对DPPH自由基的清除能力可能是葛根酒中所含异黄酮的羟基具有供氢质体能力的结果。

图3 葛根酒对1，1-二苯基-2-苯肼自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用

羟基自由基化学性质特别活泼，也是毒性最大的自由基，几乎与细胞内各类有机物反应，是造成组织脂质过氧化、蛋白质解聚与聚合、核酸断裂、多糖解聚的重要活性氧，而羟基自由基清除率是反映其抗氧化作用的重要指标[14]。Fenton反应是产生羟基自由基的重要机理。本试验中考察葛根酒对·OH的清除效果，对·OH自由基的清除率为35.67%。

邻苯三酚自氧化反应产生超氧阴离子自由基且其自身氧化产物在322nm处有紫外吸收。在pH＜9.0时，邻苯三酚自氧化速率与生成的超氧阴离子自由基浓度呈正相关，故可通过紫外吸收来定量测定抗氧化剂在此体系中对超氧阴离子自由基的清除作用，间接评价葛根酒的抗氧化能力[15]。对超氧阴离子自由基的清除率为75.36%。

在正常情况下，机体内的自由基处于动态平衡中，如果该平衡被打破，就会对机体造成损害，从而引发一系列相关疾病[16]。本实验中采用3种常用的体外抗氧化模型评价葛根酒的抗氧化活性，结果发现，葛根酒对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基都有良好的清除效果，这与里面含有大量的葛根素等异黄酮类物质有关。就3种自由基相比，葛根酒在清除超氧阴离子自由基方面显示出更强的能力，而对羟基自由基清除能力最弱。由此可知，同一抗氧化物质在不同的环境下抗氧化效力并不相同，使用时宜让其处于最佳的反应环境以发挥其最大的抗氧化功效[11]。

3 结论

葛根在预防高血压、动脉硬化、祛痰、解热，提高机体免疫能力，抗菌抗病毒、解酒、抗肿瘤及益智等方面均呈现出良好的效果，这可能与葛根在各种体系中表现出较强的抗氧化活性有关。目前，国内外已将抗氧化检测用于抗衰老等保健食品的评价，对保健食品的开发具有积极作用。本研究以葛根作为酿酒原料，酿制具有葛根风味的低度发酵酒，对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基都有良好的清除效果，为葛根中药材现代深加工中的应用提供参考依据。

[1]赖来展,戚本华,王城桂,等.葛根及葛根酒的营养功能分析[J].广东农业科学,2011,38(6):9.

[2]Zhang Z,Lam TN,Zuo Z.Radix Puerariae: an overview of its chemistry,pharmacology,pharmacokinetics,and clinical use[J].The Journal of Clinical Pharmacology,2013,53(8):787-811.

[3]Chen SB,Liu HP,Tian RT,et al.High-performance thin-layer chromatographic fingerprints of isoflavonoids for distinguishing between Radix Puerariae Lobate and Radix PuerariaeThomsonii[J].Journal of Chromatography A,2006,1121(1):114-119.

[4]Du G,Zhao HY,Zhang QW,et al.A rapid method for simultaneous determination of 14 phenolic compounds in Radix Puerariae using microwave-assisted extraction and ultra high performance liquid chromatography coupled with diode array detection and time-of-flight mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(5):705-714.

[5]Wong KH,Razmovski-Naumovski V,Li KM,et al.Comparing morphological,chemical and anti-diabetic characteristics of PuerariaeLobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix[J].Journal of ethnopharmacology,2015,164:53-63.

[6]梁彬霞,赵文红,陈仕俏,等.黑糯米葛根酒的研制开发[J].酿酒,2008,35(3):74-76.

[7]祝冬青,孔庆新.葛根保健黄酒的开发研究[J].酿酒科技,2007,28(12):82-84.

[8]汪建国.葛根清爽型黄酒的开发研究[J].中国酿造,2008,27(12X):113-114.

[9]张鹏斐,吴卫国,傅冬和,等.葛根酒的开发[J].食品与发酵工业,2012,38(2):117-121.

[10]Hu W,Wang G,Shen T,et al.Chemical composition,antioxidant and cytoprotective activities of lotus receptacle[J].Horticulture,Environment,and Biotechnology,2015,56(5):712-720.

[11]向佳兰,王茜,谢阳,等.响应曲面法优化金银花多糖提取条件及抗氧化活性研究[J].乐山师范学院学报,2015,30(12):36-41.

[12]罗秋水,杜华英,熊建华,等.葛根异黄酮类化合物提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].中国食品学报,2015,15(2):104-110.

[13]王明强,李和平,陈顺浩.超高效液相色谱法测定葛根酒中葛根素含量[J].酿酒科技,2012,33(12):103-104.

[14]马淑慧.羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究[D].泰安:山东农业大学,2009.

[15]俞梅兰,余燕影,曹树稳.槲皮素自氧化作用影响其超氧阴离子自由基清除能力的研究[J].食品工业科技,2006,28(3):75-78.

[16]葛霞,陈婷婷,蔡教英,等.青钱柳多糖抗氧化活性的研究[J].中国食品学报,2011,11(5):59-64.

Determination of Puerarin Content in Pueraria Wine and Its Antioxidantion

Xu Guo-liang,Huang Yan,Tu Zhao-xiu,Li Xiong-hui,Hu Ju-wu
(Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

SYKAM S501 Series High Performance Liquid Chromatography was used for rapid measurement of puerarin content in pueraria wine (Shimadzu Shim-pack (5 μm，4.6 mm× 250 mm),methanol∶water =35∶65 as mobile phase,and detection wavelength was 250 nm),and through measuring scavenging rate of ultra oxygen anion free radical,hydroxyl radicals (·OH) and 1， 1-diphenyl-2-phenyl-free radical (DPPH·) was to evaluate the antioxidant activity of pueraria wine in vitro.The results showed that the content of puerarin in pueraria wine was 160.83μg/mL and the scavenging rate of DPPH·,·OH and·free radical reached 53.1%,35.67% and 75.36%respectively.This shows that puerarin wine contains many puerarin compound,which has strong antioxidant activity in vitro and has healthcare functions.

Puerarin wine;Puerarin;High Performance Liquid Chromatography;Antioxidant activity

O657.7；TS262.91

A

2096-0387（2017）03-0023-04

徐国良（1964-），男，本科，副研究员，研究方向：天然产物。