超高效液相色谱-串联质谱法联合衍生化测定大鼠脑透析液中多巴胺和5-羟基色胺

卢金莲，胡维民，曹卫群，陶怡*，张旭敏

（1.上海药明康德新药开发有限公司生物分析部，上海200131；2.复旦大学生命科学学院，上海200433）

超高效液相色谱-串联质谱法联合衍生化测定大鼠脑透析液中多巴胺和5-羟基色胺

卢金莲1，2，胡维民1，曹卫群1，陶怡1*，张旭敏2

（1.上海药明康德新药开发有限公司生物分析部，上海200131；2.复旦大学生命科学学院，上海200433）

本文建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）结合衍生化的方法，并快速测定大鼠脑组织微透液中多巴胺（DA）和5-羟基色胺（5-HT）的浓度。采用苯甲酰氯衍生化的方法进行透析液样品预处理。在2.3min分析时间内，各组分得到很好的分离。使用10μL透析液样品，DA和5-HT的定量下限可分别达到10pg/mL和5pg/mL，DA的线性范围为10～5 000pg/mL，5-HT的线性范围为5～2 500pg/mL，决定系数（R2）大于0.99。通过对质量控制样品的分析，该方法的灵敏度和精密度得到了验证。此方法可以成功地应用于微透析研究这两种神经递质的基础水平检测。

多巴胺；5-羟基色胺；微透析；神经递质；液质联用

微透析技术（Microdialysis）是一种可以从清醒活体获取细胞间隙 液的取样技术，其可以实时动态检测目标组织中生物化学物质含量的变化。同时，其是一种微创的采样技术，几乎可以被用于连续测量任何组织的细胞外液中游离及结合分析物的浓度[1]。其能监测完整细胞外液物质（包括内源性和外源性）的动态变化，是目前在生理和病理情况下，研究活体药物脑内分布、药物透过血脑屏障情况及监测脑内药物有效活性物质和神经递质变化的方法[2，3]。微透析技术已日益成为药物脑部研究的重要工具[4-8]。

神经递质广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统、脑组织和体液中，其痕量测定对神经生理学、运动生理学、病理学、临床医学及疾病诊断等具有重要意义。阿尔兹海默病、帕金森、亨丁顿舞蹈症皆为神经系统疾病且都与单胺类神经递质水平异常有关[9]。因此，在新药研发过程中，能够快速、准确地监测给药前后，脑透析液中此类神经递质的水平变化，对新药的筛选、评价有非常重要的意义。

脑透析液的样品一般具有以下几个特点：①脑组织细胞间质中大多数神经递质的浓度都非常低；②样品量非常有限；③使用的灌注液中含有的无机离子可能会影响神经递质的定量分析[10]。因而，微透析技术需与分离效果好、定量准确、灵敏度高的分析方法相结合，才能在样品量有限的前提下检测到脑透析液中痕量的神经递质。由此可见，建立一种灵敏度、重现性、分离度好的分析方法，是微透析研究成功的关键因素。分析方法一旦建立，还可以应用于血浆、尿液、组织等其他生物样品中神经递质的测定。

由于单胺类神经递质的浓度低于其他类神经递质（pmol/L级），所以其分析难度远高于其他类神经递质，缺乏快速高效的样品前处理方法和高灵敏的检测手段仍是目前深入开展研究的瓶颈[11]。目前检测单胺类神经递质的方法主要有分光光度法、化学发光法、化学荧光法、液相色谱法、电化学法和毛细管电泳法等[12，13]。前两种方法由于灵敏度的限制，很少应用于微透析样品检测。高效液相色谱法与荧光法、电化学检测法、质谱法的联用是目前比较常用的分析方法[14-18]。高效液相色谱与荧光光谱法联用，灵敏度高，选择性好，线性范围较宽，受外界条件的影响较小。但并不是所有的目标检测物在相同的条件下都能发生荧光，因而其应用范围较窄，在进行定量分析时，同时需要排除背景荧光和猝灭效应等的影响，并且需要确保作为流动相的溶剂在选择的激发光照射下不会发射荧光，否则不能进行梯度洗脱。此外，高效液相色谱与荧光法联用往往需要较长的分析时间（10～60min），且需要对样品进行前处理[15-17]。电化学检测法优点是灵敏度高、选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质、线性范围宽，但不能同时检测多个神经递质，电极有被污染的风险，而且有时候会出现干扰峰，干扰目标分析物的定量[12，18-19]。与其他技术相比，液相色谱-质谱联用技术是目前普遍适用于与微透析结合进行分离、分析的技术。超高效液相色谱能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究[20-22]。

目前，运用液相色谱-质谱联用方法检测脑透析液中单胺类的神经递质多巴胺（DA）和5-羟基色胺（5-HT）主要有以下难点：①为了改善相对回收率，微透析经常采用较低的流速（0.5～5.0μL/min），因此微透析技术常承受着样品量低的困扰[3]；②细胞间质中大多数神经递质的浓度都非常低，特别是单胺类神经递质，所以要求非常低的定量下限；③待测物在质谱上的响应较低，而且极性大，在反相色谱上难保留。本文针对这些难点，用化学衍生化结合反相超高效液相色谱-串联质谱法，建立了一种简单、快速、易操作的检测方法，同时检测DA和5-HT。

1 试验部分

1.1 仪器和试剂

AB SCⅠEX QTRAP 6500+质谱（AB SCⅠEX）；ACQUⅠTY UPLC 超高压液相和自动进样器（Waters）；Milli-Q 超纯水净化器（Millipore）；微型涡旋混合仪（上海汾西分析仪器厂）；多管混匀仪（Fisher Scientific）；1.5mL离心管（Eppendorf）；96孔进样板（Corelle Life Science Co.Ltd.）。

乙腈，甲醇（色谱纯，Merck）；人工脑脊液（Artificial CSF）（Harvard apparatus）；苯甲酰氯，纯度≥99%（Sigma-Aldrich）；四硼酸钠，纯度99.5%（Alfa Aesar）。

1.2 标准品及内标

盐酸多巴胺（DA）、5-羟基色胺盐酸盐（5-HT）纯度分别99.9%和99%，购买于Sigma Aldrich；同位素内标2-(3,4-Dihydroxyphenyl) ethyl-1,1,2,2-d4-amine HCl (d4-DA)、Serotonin-α,α,β,β-d4 Creatinine Sulfate Complex (d4-5-HT)购买于C/D/NⅠsotopes Ⅰnc.。

1.3 试验方法

1.3.1 样品衍生化方法

四硼酸钠粉末称重后，配制100mM水溶液备用，加热后溶解。取10μL透析液样品加入1.5mL离心管中，然后依次加入25μL四硼酸钠水溶液和25μL2%苯甲酰氯乙腈溶液，摇匀之后室温震荡30min，反应完成，将样品转移至96孔进板，准备进样。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：ACQUⅠTY UPLC☒ BEH C18 2.1mm×50mm Ⅰ.D.，1.7μm（Waters）；柱温55℃，流速0.6mL/min，进样量15μL；流动相A，0.025%甲酸和1mmol/L乙酸铵在5%乙腈溶液中；流动相B，0.025%甲酸和1mmol/L乙酸铵在95%乙腈溶液中；洗脱梯度如表1所示。

表1 液相洗脱梯度

1.3.3 质谱条件

电离模式，电喷雾离子化；离子源，涡轮喷雾；雾化气，65psi；辅助加热气，65psi；气帘气，40psi； 喷雾电压5500V；离子源温度500℃；扫描模式，正离子多反应离子监测，参数如表2所示。

表2 多巴胺，5-羟基色胺及同位素内标的母离子，子离子，碰撞能量和保留时间

1.3.4 数据采集和处理

化合物和内标的保留时间、色谱图采集和色谱图的积分及数据的统计由软件Analyst（Applied Biosystems，版本号1.6.3，Foster City，CA，USA）进行处理。校正曲线以1/x2为加权系，用峰面积比值（分析物/内标）对校正标样中DA和5-HT的浓度进行线性回归。

1.3.5 校正曲线和质控样品的配制

称量DA和5-HT的标准品，分别用20%乙腈溶液溶解成1mg/mL的标准品储备液，存储于-80℃冰箱备用。

分别量取DA和5-HT的标准品储备液（1mg/mL在20%乙腈/水溶液中），用20%乙腈稀释到10μg/mL和5μg/mL作为储备液1；然后继续稀释20倍，得到200ng/mL和100ng/mL的储备液2；最后，用人工脑脊液稀释成DA浓度范围为10～5 000pg/mL，5-HT浓度范围为5～2 500pg/mL的校正曲线。质控样品用相同的方式配制成定量下限、低、中和高4个浓度。

2 结论和讨论

2.1 衍生化反应路径

DA和5-HT的结构中都有氨基，可以与醛、酮反应或与酰卤反应来衍生化[23，24]。与醛、酮反应相对与酰卤反应来说反应条件较复杂，通常需要较长的反应时间或者严格的pH控制。本文采用苯甲酰氯作为衍生化试剂，对DA和5-HT进行羟基和氨基的酰化反应。例如，苯甲酰氯可以与DA的氨基及2个酚羟基发生反应，共3个分子的苯甲酰氯结合在DA上，衍生化的结合位点及路径如图1所示。

图1 多巴胺衍生化路径

2.2 线性范围

大鼠脑部微透析的动物试验是将灌注液（Artificial CSF）通过探针灌注到目标位置，由于灌注液的稀释，微透析样品中神经递质的浓度要低于在大脑中的浓度。因此，微透析样品中神经递质的检测限越低越好。该试验中，DA的线性范围为10～5 000pg/mL，校准曲线的浓度设置由低到高分别是10、20、50、250、500、2 500、4 250pg/mL和5 000pg/mL；5-HT的线性范围为5～2 500pg/mL，校准曲线的浓度设置有低到高分别是5、10、25、125、250、150、2 125pg/mL和2 500pg/mL。标准曲线采用线性回归，DA和5-HT的校正曲线决定系数（R2）分别0.995 2和0.999 5。

2.3 分析方法灵敏度

DA和5-HT的定量下限具有良好的信噪比和灵敏度。在人工脑脊液中的定量下限分别是10pg/mL和5pg/mL，DA和5-HT的定量下限色谱峰如图2所示。

图2 DA和5-HT的定量下限色谱峰

2.4 准确度和精密度

准确度和精密度通过定量下限、低、中、高4个浓度，每个质控样品浓度水平6个测定值来评价以考察方法的准确性和精密度，DA的4个质控样品浓度分别为10、30、1 500、4 000pg/mL，平均的准确度为98.6%～107.7%，变异系数为1%～13%；5-HT的4个质控样品浓度分别为5、15、750、2 000pg/mL，平均的准确度为95.8%～111.8%，变异系数为2%～5%。

2.5 实际样品检测

利用微透析技术采集脑部透析液，每隔20min采集一次，在40min处大鼠给药安非他命（Amphetamine）2mg/kg，得到的安非他命，在给药前后脑透析液中DA和5-HT的浓度变化情况如图3所示。结果显示，本方法能够检测大鼠在给药前脑部透析液中DA和5-HT的基础水平，以及给药之后透析液中DA和5-HT随时间的变化情况。由此说明，本方法灵敏度高，可满足大鼠脑微透析试验的样品检测。

图3 安非他命及多巴胺和5羟基色胺在给药安非他命前后在大鼠脑透析液中的变化

3 结论

本文成功开发了超高压液相-串联质谱结合衍生化检测人工脑脊液中DA和5-HT的方法，本方法的优点是：①定量下限低，完全满足微透析样品检测需求，可以检测到透析液样品中DA和5-HT的基础水平；②操作简单，衍生化方法简单、快速、易操作、重现性好，反应仅需30min，可进行批量样品处理；③UPLC-MS/MS 方法快速，仅2.3min即可达到很好的分离效果，并且通过衍生化处理，改善了DA和5-HT在反相色谱上的保留，尤其显著提高了质谱响应；④本方法检测限低，线性范围良好，同时具有较好的准确性和精密度。

此方法不仅可用于大鼠脑微透析样品检测，前处理方法稍加改变即可应用于其他生物基质的样品检测。

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Simultaneous Quantification of Dopamine and 5-hydroxytryptaphane in Rat Brain Dialysate by Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Lu Jin-lian1,2,Hu Wei-min1,Cao Wei-qun1,Tao Yi1*,Zhang Xu-min2
(1.Non-GLP BAS,WuXiAppTec,Shanghai 200131;2.School of Science,Fudan University,Shanghai 200433)

In this paper,a method was developed for the combination of ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) and derivatization,to determine the concentration of dopamine (DA) and 5-hydroxytryptaphane (5-HT) in the rat brain dialysates.Benzoyl chloride was used as derivatization reagent.The components were well separated in the 2.3min.Using 10 μL dialysate samples,the lower limit of DA and 5-HT could reach 10 pg/mL and 5 pg/mL respectively,the linear range of DA was from 10 to 5 000 pg/mL,the linear range of 5-HT was from 5 to 2 500 pg/mL,and the determination coefficient (R2) was greater than 0.99.The sensitivity and precision of the method were verified by the analysis of the quality control samples.This method can be successfully applied to the microdialysis study of the basal level detection of both the neurotransmitters.

Dopamine;5-hydroxytryptaphane;Microdialysis;Neurotransmitter;Liquid chromatography-mass spectrometry

R446.1；O657.63

A

2096-0387（2017）03-0035-05

卢金莲（1987-），女，辽宁丹东人，硕士在读，研究方向：生物样本定量分析。

陶怡（1974-），女，河北天津人，博士，研究方向：生物分析。