辛伐他汀对肾缺血再灌注损伤大鼠脑组织OFR NO和NOS的影响*

荆 娇， 张永忠， 闫文升， 马海玲， 张玉清， 焦宗伟

(石家庄医学高等专科学校, 河北 石家庄 050000)

辛伐他汀对肾缺血再灌注损伤大鼠脑组织OFR NO和NOS的影响*

荆 娇， 张永忠， 闫文升， 马海玲， 张玉清， 焦宗伟

(石家庄医学高等专科学校, 河北 石家庄 050000)

目的：观察辛伐他汀对肾缺血再灌注损伤后对脑组织的影响及影响机制。方法：复制肾缺血再灌注损伤(RIRI)模型(10%水合氯醛腹腔麻醉,打开腹腔，暴露双侧肾动静脉,用动脉夹夹闭双侧肾动静脉,45min后去除动脉夹恢复血流,然后再逐层缝合腹壁)。随机将36只大鼠分为3组:假手术组;肾缺血再灌注组;辛伐他汀组。每组12只。检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量,检测脑组织丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性以及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白表达水平。结果:与假手术组比,缺血组血清Scr、BUN水平升高(P<0.05)脑组织MDA、NO含量以及iNOS活性均都升高(P<0.05),而SOD活性明显下降(P<0.05)。与缺血再灌注组比较,辛伐他汀组血清SCr、BUN水平降低(P<0.05)和脑组织MDA的含量降低(P<0.05),iNOS活性亦降低(P<0.05),SOD活性和NO含量增加(P<0.05)。肾缺血再灌注组eNOS蛋白含量与假手术组相比增加(P<0.05),与肾缺血再灌注损伤组相比,辛伐他汀组eNOS蛋白含量增加(P<0.05)。结论:辛伐他汀对肾缺血再灌后脑组织的损伤有一定的保护作用。其机制与辛伐他汀可以清除自由基,降低iNOS含量,提高eNOS的表达,同时增加NO含量有关。

辛伐他汀； 氧自由基； 一氧化氮； 一氧化氮合酶

他汀类(statins) 药物是三羟基三甲基戊二酰辅酶A (HMG-COA)还原酶抑制剂。自1976 年Endo等[1]于桔霉素提取液中发现了美伐他汀(mevastatin) ,随后洛伐他汀(lovastatin ) 等他汀类药物相继问世。他汀类药物通过对该酶特异性抑制作用, 使HMG-CoA不能转变为甲羟戊酸,从而阻断胆固醇的合成，这一作用目前在临床上广泛用于高血脂的治疗。近年来有研究发现,普伐他汀预处理可以通过抑制细胞凋亡保护肾缺血再灌损伤[2]。也有研究指出辛伐他汀可以参与脑血管的再生和组织的修复[3]。但辛伐他汀对肾缺血再灌后脑组织的影响少有报道。我们就此进行了初步研究，通过建立肾缺血再灌注损伤模型，并用辛伐他汀干预，检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量,检测脑组织丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性以及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白表达水平。探讨辛伐他汀对肾缺血再灌后脑组织的作用，结果如下:

1 材料与方法

1.1 实验动物：健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,体重160～230g,购自河北省实验动物中心。

1.2 药品与试剂：辛伐他汀，杭州上虞京新药业有限公司提供；血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)测试盒，购自北化康泰临床试剂有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒均购自南京建成生物制品公司；β-actin、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)购自Santa cruz biotechnology。

1.3 仪器：HW1电热恒温水温箱；LXJ-Ⅱ离心机；GPR低温低速离心机；EW-3000A电子天平；分析天平；721分光光度计；SN-682B全自动γ记数仪；DYY-Ⅲ型电泳仪；酶标分析仪；超低温冰箱；凝胶分析系统；X线摄影暗匣；塑料薄膜封口机；电热保温干燥箱；隔水式电热恒温培养箱。

1.4 分组与模型建立：将大鼠在20～26℃实验室喂养两天,然后随机分成3组:①假手术组(Sham);②肾缺血再灌注组(IR);③辛伐他汀组(Sim)。每组12只。完全随机分组方法如下：先将动物按1，2，3，4……36编号，在随机数字表中第三行第一个数16为开始数，取数取36个随机数，将对应的随机数放在鼠号下面，用随机数除以组数3，余数为1归为假手术组，余数为2归肾缺血再灌注组，余数为3归为辛伐他汀组，再进行随机分组调整完成分组。分组后,辛伐他汀组20mg·kg-1·d-1灌胃,持续2周。假手术和缺血组组每天给同量的自来水灌胃。2周之后复制模型。

复制模型，采用河北省医学科学院的以往方法[4]，10%水合氯醛腹腔麻醉,剖腹手术,双侧肾动静脉暴露。IR组和Sim组夹夹闭双侧肾动静脉,45min后去除动脉夹再恢复血流灌注,然后逐层缝合腹壁。Sham组开腹但不夹闭血管,其余相同。再灌后24h各组分别腹主动脉取血4～5mL，分离留取血清于冰箱中低温保存，待测定血清Scr、BUN含量。

断头取脑[5]用大鼠断头器迅速断头并将其置预先准备的冰盘内降低温度，在冰浴中快速开颅，剪掉颅骨表面的皮肤和肌肉组织，用咬骨钳咬开枕骨大孔及枕骨，暴露脑干和小脑以及顶骨后缘，用钳夹每侧顶骨后缘向两侧搬开顶骨，暴露两侧大脑半球，然后用咬骨钳咬掉两侧颞骨及部分额骨大部分，露出脑组织。用眼科剪将脑干小脑侧颅神经剪断并剪开硬脑膜，轻轻撬起脑干再剪断颅底三叉神经和视神经将整个脑与颅底结构分离，最后剥离嗅脑并取出完整脑，制备匀浆待检测MDA,NO含量,SOD,iNOS的活力,以及eNOS的表达水平。

1.5 检测方法：生化检查:用苦味酸不除蛋白法完成血清Scr测定;BUN含量测定采用OPA法;采用nitrate reductase法测定NO含量,Thiopentone法测定MDA含量;xanthine oxidase法测定SOD活性;测定NO与亲和性物质生成有色化合物的吸光度,据其计算NOS活性; 各项指标检测方法严格按说明书操作。

脑组织匀浆制备 制备匀浆前除去组织血液，用滤纸吸干，准确称重。将干净、干燥的匀浆管置于冰水混合物中，将组织块放于匀浆管中，尽快剪碎组织，然后按1: 9(W/V)加入冰生理盐水，将组织匀浆。而后将匀浆移入干燥的试管中，置于4℃离心机中，以3000r/min的速度离心10min。取上清液储存待测。

Western blot 法检测eNOS的表达 提取蛋白后灌胶上样(30μg)，加样后先用恒流(10 mA)，再用恒压 (100 V) 电泳至溴酚蓝到凝胶底部。待电泳停止后，将凝胶转移到PVDF 膜上，转移电压为 100 V，时间120 min。然后将 PVDF膜移至含有封闭液的平皿中，室温下摇床上摇动封闭2h。取出PVDF膜，加入稀释后的一抗冰箱里4℃过夜。再用TBST室温下脱色摇床上洗3次，每次10min。然后加入1:1000稀释的辣根酶标记羊抗兔IgG抗体室温孵育1h，用TBST室温下脱色摇床上洗5次，每次10min。将显色剂滴加于晾干的PVDF膜上，显色照相。最后用quantity one软件对条带进行分析。

1.6 统计分析：应用SPSS23.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示,采用单因素方差分析和SNK检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 辛伐他汀对血清尿素氮和血清肌酐含量的影响(见表1)：与sham组比较，IR组肾功能受损,肌酐和尿素氮含量增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与IR组比较Sim组肌酐和尿素氮含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 辛伐他汀对脑组织SOD活性、MDA含量的影响(见表2)：与Sham组比较,IR组SOD活性降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05)差异都有统计学意义。与IR组相比,Sim组SOD活性升高(P<0.0),MDA含量则降低(P<0.05)，差异也具有统计学意义。

2.3 辛伐他汀NO及iNOS的影响(Table2)：IR组NO含量和iNOS活力较Sham组比升高，两组比较有差异(P<0.05);与IR组比较,Sim组NO含量升高,iNOS活力降低，差异有统计意义(P<0.05)。

2.4 辛伐他汀对肾缺血再灌注后脑组织eNOS蛋白含量的影响：IR组eNOS蛋白含量较Sham组增加,与IR组比较,Sim 组eNOS蛋白含量明显增加。

表1 辛伐他汀对血清尿素氮和血清肌酐含量的影响 ( ±s，n=12)

注：与辛伐他汀组比较△P<0.05 ； 与肾缺血*P<0.05vs肾缺血再灌注组

表2 辛伐他汀对脑组织活性的影响±s,n=12)

注：与辛伐他汀组比较△P<0.05；与肾缺血 *P<0.05vs肾缺血再灌注组

3 讨 论

肾缺血再灌注损伤涉及多种因素,如自由基损伤、白细胞和内皮细胞之间的作用、胞内钙的超载、NO等[6]。以往的研究指出[7],缺血缺氧可以引起血管内皮细胞的损伤和脂质过氧化物增多,这是引起肾缺血再灌注损伤的关键因素之一。氧化应激是机体内氧自由基生成和去除失衡,或者由于外源性氧化剂超量摄入,导致活性氧(Reactive oxygen ROS)的积累而引起的毒性过程。在生理状态下,机体产生超氧化物歧化酶能快速清除氧自由基等,防止氧自由基的过量积累。Laude K研究报道缺血再灌注期间可以产生的大量的OFR，这些过量的自由基经过血液循环到达相应的靶器官造成器官的损伤[8],虽然经过循环后的OFR浓度有所降低,但产生的各种损失因子也可引起相关器官处OFR相对增加,而引起器官损伤。

本次实验采用河北省医学科学院的以往方法[4],复制肾缺血再灌注损伤模型(夹闭大鼠双侧肾动脉静脉45min后去夹再灌注)，观察再灌后24h各项指标变化。结果表明,缺血再灌组肾功能明显受损,肌酐和尿素氮高于假手术组(P<0.05)。辛伐他汀组肌酐和尿素氮含量明显低于缺血再灌注组(P<0.05),动物模型复制成功。缺血再灌注后,脑组织中丙二醛含量增加,超氧化物歧化酶活性降低(P<0.05),而给予辛伐他汀后,丙二醛含量降低,超氧化物歧化酶活性显著提高(P<0.05)。这说明辛伐他汀对肾缺血再灌注远程器官脑组织有一定的保护作用。

NO有内外源性两方面。前者主要来自NO的供体;后者由精氨酸和氧在NOS的作用下合成的。NOS有原生型和诱生型两种。原生型NOS又包含内皮细胞NOS(eNOS)和神经源性NOS(nNOS)。内皮细胞生成的eNOS 在正常生理情况下, 维持体内一定量的NO产生,对机体调节血管紧张度和血压、松弛支气管平滑肌、抑制血小板聚集起重要作用[6～8]。一些研究表明他汀类药使NO合成增加、活性增强[9,10]。Laufs U也指出NO则可能通过舒张血管,对抗内皮素的作用,从而在肾缺血再灌注中发挥有益作用[11]。iNOS具有负性调节作用,它可促进NO的合成,后者可通过氧化应激、损伤线粒体、促进细胞凋亡以及胞内钙超载等途径发挥作用,从而使组织受损。也有研究表明在生理情况下,机体内NO和OFR处于动态平衡并无损伤作用,当平衡破坏时,NO合成过多,NO与OFR生成羟自由基和过氧硝基阴离子,后者的细胞毒性比OFR更强,损伤作用也更强。 本实验结果,肾缺血再灌注后脑组织明显受损,iNOS 的表达上调,产生过量的NO,生成的NO可能通过氧化应激、损伤线粒体、促进细胞凋亡等途径参与各种组织损伤的过程。辛伐他汀组eNOS 表达,NO大量产生, 此时产生 NO 对则可能通过调节血管紧张度和血压、松弛支气管平滑肌等途径改善受损的脑组织功能，具体机制有待进一步的研究。

[1] Endo A, Kuroda M. Citrinin, an inhibitor of cholesterol synthesis[J].Antibiot (Tokyo), 1976, 29(8):841～843.

[2] 金健，朴尚国，金顺英等.普伐他汀对肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的探讨[J].中华肾脏病杂志，2014，30(3)：138～144.

[3] 刘国庆.辛伐他汀对大鼠脑创伤后内皮祖细胞动员和损伤脑组织血管再生影响[M].天津：天津医科大学,2009.

[4] Xia Xiao-hong, Shen Yu-xue,Shi Ji-cai,et al.Antibody of endothelin in renal ischemia/reperfusion injury in rats[J].Chinese Journal of Pathophysiology, 1999, 15(5): 415～417.

[5] 高永强,杨巧莲,王伟.大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究[J].包头医学院学报,2009,29(4):6～9.

[6] 仝飞，夏晓红.短暂反复缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D].石家庄：河北医科大学,2011.

[7] Yi Shi-hua. L - arginine and research progress of cardiovascular disease[J].Cardiovascular epidemiology,2000, 21(4): 234～236

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[9] Varela M, Garvin JL. Acute and chronic regulation of thick ascending limb endothelial nitric oxide synthase by statins[J].AmSoc Nephrol, 2004, 15:269～275.

[10] Takemoto M, Sun J, HIRoki J, et al. Rho-kinase mediates hypoxia induced downregulation of endothelial nitric oxide synthase[J].CIRculation, 2002, 106:57～62.

[11] Laufs U, La Fata V, Plutzky J, et al. Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by HMG -CoA reductase inhibitors[J].CIRculation, 1998, 97 (12):1129～1135.

Effects of Simvastatin on OFR, NO and NOS in Brain Tissue of Rats with Renal Ischemia Reperfusion Injury

JINGJiao,ZHANGYongzhong,YANWensheng,etal

(ShijiazhuangMedicalCollege,HebeiShijiazhuang050000,China)

Objective:To observe the effect of simvastatin on brain tissue after renal ischemia reperfusion injury and its mechanism. Methods: A rat model of renal ischemia reperfusion injury (RIRI) was prepared by clamping the bilateral renal arteries for 45 minutes(10% chloral hydrate intraperitoneal anesthesia, open the abdominal cavity, exposed bilateral renal artery and vein, clamping the bilateral renal artery and vein with artery clamp, 45min after removal of the artery clamp to restore blood flow, and then suture the abdominal wall). 36 rats were randomly divided into the following groups, 12 rats in each group: sham operation group; renal ischemia reperfusion group; simvastatin group. Detection of serum creatinine (Scr), urea nitrogen (BUN), brain tissue malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) content, superoxide dismutase (SOD) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity in brain tissue was detected in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) protein expression level. Results: Compared with the sham operation group, the contents of Scr, BUN, MDA, NO and iNOS activity in the ischemic group increased (P<0.05), while the activity of SOD decreased (P<0.05). Compared with the ischemia reperfusion group, the content of SCr, BUN and MDA decreased, iNOS activity was decreased (P<0.05), but the activity of SOD and the content of NO increased (P<0.05). The content of eNOS protein in renal ischemia reperfusion group was higher than that in sham operation group (P<0.05), and the content of eNOS protein in simvastatin group was higher than that in the renal ischemia reperfusion injury group (P<0.05). Conclusion:Simvastatin can protect the brain from ischemia reperfusion injury. It may be related to decreased the activity of iNOS, and increase the expression of eNOS protein and the content of NO.

Simvastatin; Oxygen free radical; Nitric oxide; Nitric oxide synthase

1006-6233(2017)06-0941-04

河北省教育厅高等学校科学技术指导性研究项目,(编号：Z2014020)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.018