转染ELF5mRNA对子宫内膜癌细胞凋亡及周期的影响

戚 挺， 踪佳鹏， 闫洪超

(1.徐州医科大学研究生学院， 江苏 徐州 221000 2.江苏省徐州市第一人民医院产科， 江苏 徐州 221000 3.徐州医科大学附属医院妇产科， 江苏 徐州 221000)

转染ELF5mRNA对子宫内膜癌细胞凋亡及周期的影响

戚 挺1， 踪佳鹏2， 闫洪超3*

(1.徐州医科大学研究生学院， 江苏 徐州 221000 2.江苏省徐州市第一人民医院产科， 江苏 徐州 221000 3.徐州医科大学附属医院妇产科， 江苏 徐州 221000)

目的：检测人子宫内膜癌Ishikawa细胞转染pcDNA3.1-ELF5+EGFP后ELF5基因的表达，并观察其对Ishikawa细胞凋亡情况及周期变化的影响。方法:通过脂质体介导的方法将pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核细胞表达载体体外转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞，设立实验组(转染pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核载体)、空质粒组(转染pcDNA3.1-EGFP空载体)、空白对照组(未经转染的Ishikawa细胞)。体外实验：用qRT-PCR法检测子宫内膜癌Ishikawa细胞中ELF5mRNA的表达情况，MTT法检测ELF5mRNA对Ishikawa细胞增殖的影响，流式细胞仪检测三组细胞周期及凋亡情况，Western blot法检测三组肿瘤组织的细胞周期调控蛋白P21及凋亡调控因子Caspase-3表达情况的变化。体内实验：将三组细胞分别接种于NOD/SCID雌性裸鼠，观察肿瘤生长情况及测定成瘤能力，应用TUNEL法检测三组肿瘤组织细胞凋亡的情况，采用蛋白印迹法检测三组肿瘤组织的细胞周期调控蛋白P21及凋亡调控因子Caspase-3表达情况的变化。结果:重组质粒pcDNA3.1-ELF5+EGFP成功转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞；重组质粒组细胞ELF5mRNA的表达明显高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；重组质粒组各时间点的细胞增殖能力较较其他两组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；重组质粒组G0/G1期的细胞比例均高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；重组质粒组细胞凋亡率分别与空质粒组及空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；重组质粒组细胞中P21及Caspase-3的表达明显高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。重组质粒组裸鼠体内的成瘤能力(瘤组织最大直径、重量)明显低于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；重组质粒组裸鼠体内瘤组织细胞凋亡率分别与空质粒组及空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；(9)重组质粒组裸鼠体内瘤组织P21及Caspase-3的表达明显高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:ELF5基因可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖，将细胞周期阻滞于G0/G1期，并诱导其凋亡，其机制可能与P21及Caspase-3有关。

ELF5基因； 卵巢癌细胞； 转 染； 细胞周期； P21； Caspase-3； 细胞凋亡

子宫内膜癌(Endometrial Cancer)是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，在中国近年也有明显的上升趋势[1]。作为子宫内膜癌的癌前病变，EIN(子宫内膜上皮内瘤样病变)的级别越高，发展为子宫内膜癌的机会越多。大约80%子宫内膜癌早期手术治疗是有效的，与其它肿瘤相比预后较好。但由于缺乏有效的早期诊断方法，许多患者错过了最佳治疗时机。因此，积极寻求各种与子宫内膜癌、EIN相关的指标，以用于子宫内膜癌及EIN的早期诊断和治疗，已成为有关子宫内膜疾病研究的热点。子宫内膜癌的发生涉及多基因、多步骤的复杂过程[2]，深入研究控制子宫内膜癌发生、发展过程中关键基因的作用，对子宫内膜癌的早期诊断、早期治疗及预后有重要意义。近年来研究表明，ELF5是一个潜在肿瘤抑制因子，ELF5在乳腺癌的发生及发展过程中发挥着抑癌基因的作用[3]。而关于ELF5基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞周期与凋亡的影响及其可能的机制尚无报道。本课题组前期研究成功构建了含有ELF5基因的pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核细胞表达载体[4,5]，并在预实验研究中证实：ELF5蛋白在子宫内膜癌组织中表达明显低于在子宫内膜不典型增生组织及正常子宫内膜组织。为了探讨ELF5基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞周期与凋亡的影响和作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料:子宫内膜癌Ishikawa细胞由徐州医科大学附属医院提供；pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核细胞表达载体由本课题组构建并保存；Liptapfector脂质体转染试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；逆转录试剂盒、引物合成由日本TaKaRa公司提供；MTT试剂、AnnexinV-FITC流式细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒购自南京凯基生物科技公司；ELF5一抗购自美国Chemicon公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:Ishikawa细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中贴壁生长，根据细胞生长状态换液，待细胞铺板70%～80%时传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 基因转染及分组:采用脂质体转染法，将pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核细胞表达载体体外转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞(重组质粒组)，具体操作按Liptapfector 2000脂质体转染试剂盒说明书进行，用G418筛选稳定转染的阳性Ishikawa细胞并扩增培养；同时以转染空载质粒pcDNA3.1-EGFP(空质粒组)及未经转染的Ishikawa细胞(空白对照组)作为对照。

1.2.3 体外实验

1.2.3.1 实时荧光定量PCR法检测细胞ELF5mRNA的表达情况:转染72h后收集3组细胞，按RNA提取试剂盒说明书分别提取总RNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳。1μg总RNA加1μL DNase I去除DNA杂质。取提纯后RNA 2 μg按试剂盒说明在冰上将各种反应物混合形成20μL反应体系，反转录获得cDNA。利用delta-delta Ct法，再通过β-Actin的校正，最后对各组RNA中的ELF5mRNA表达量进行分析。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3.2 MTT比色法检测细胞增殖：取对数生长期的Ishikawa细胞，25%胰蛋白酶消化，按每孔1×104个细胞接种于96孔板，每组样本设6个复孔，分别培养24h、48h、72h后每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，培养箱孵育4h，小心吸弃上清，每孔加入150μL DMSO，平板床摇匀(避光)，置酶标仪于490nm波长处检测每孔的吸光值(A490)，计算各组细胞的增殖抑制率。实验重复3次。

1.2.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况:收集三组细胞，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，加入2mL完全培养液终止消化，置于离心机1000rpm离心5min，弃上清，预冷PBS洗涤细胞3次(1000rpm，5min)，收集细胞于流式管中，加入500μL 的Binding Buffer 重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混匀后室温避光反应5～15min，1h内上机检测。上述实验重复3次。

1.2.3.4 流式细胞仪检测细胞周期:收集三组细胞，PBS洗涤、离心后调整细胞浓度为1×106/mL，70%乙醇固定，PBS洗涤后每管加入100μL RNAase A 37℃水浴30min，再加入400μL PI染液混匀，4℃避光30min，上机检测，用Flow Jo软件分析各组细胞周期的比例。上述实验重复3次。

1.2.3.5 Western免疫印迹法检测蛋白表达:取生长期的三组细胞，分别于细胞裂解液(200μL)中冰上裂解，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳分离蛋白后，进行转膜实验，用封闭液进行封闭实验后，加入1∶1000的ELF5一抗(兔抗人)，4℃过夜，与1∶10000的羊抗兔二抗室温下反应，加入化学发光试剂ECL，最后进行曝光、显影剂扫描。用Image J图像分析系统对图像进行扫描，各组细胞中目的蛋白的表达水平以目的蛋白条带的灰度值与内参(β-Actin)的灰度值的比值表示。

1.2.4 体内实验：①动物分组NOD/SCID雌性裸鼠(鼠龄4～6周)15只，随机分为重组质粒组、空质粒组及空白对照组，每组各5只；饲养于恒温(25～27℃)、恒湿(45%～50%)、新鲜空气、高度除尘除菌及无特殊病原体的环境中，用灭菌处理的水和饲料供小鼠自由摄入。②动物接种及处理:取生长期的三组细胞悬液，按2×104/mL浓度分别接种于裸鼠右腋窝皮下，每周两次观察肿瘤生长情况；待成瘤后取肿瘤组织，并测定其最大直径及重量。并对瘤组织进行HE染色观察移植瘤组织的病理学特点。③TUNEL法检测裸鼠体内瘤组织细胞凋亡的情况:取三组细胞裸鼠体内的瘤组织切片，常规脱蜡水合，0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性，0.1mg/mL蛋白酶K消化40min，TdT反应液、链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SP-HRP)37℃各作用1h，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。具体操作按TUNEL检测试剂盒说明书进行，镜下计数凋亡细胞并计算凋亡率。④Western blotting法检测裸鼠体内瘤组织P21、Caspase-3蛋白的表达:取三组细胞裸鼠体内的瘤组织，分别匀浆后提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白后，进行转膜实验，用封闭液封闭后，加入1∶1000的ELF5一抗(兔抗人)，4度C孵育过夜，与1∶10000的羊抗兔二抗室温下反应，加入化学发光试剂ECL，最后进行曝光、扫描。

2 结 果

2.1 转染pcDNA3.1-ELF5+EGFP至子宫内膜癌Ishikawa细胞:采用脂质体转染法将pcDNA3.1-ELF5+EGFP转染至人子宫内膜癌Ishikawa细胞，感染48h后荧光显微镜观察绿色荧光表达较强，通过比较同一区域荧光视野和明视野下细胞荧光表达情况，可知细胞转染效率在80%以上。见图1。

2.2 转染ELF5基因后Ishikawa细胞ELF5 mRNA表达的变化:实时荧光定量PCR法检测显示，重组质粒组细胞ELF5 mRNA的表达均高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 pcDNA3.1-ELF5+EGFP转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞48h后荧光图

A:对照组绿色荧光表达;B:对照组细胞形态;C:实验组绿色荧光表达;D:实验组细胞形态

图2 ELF5mRNA的表达情况

1.重组质粒组；2.空质粒组；3.空白对照组

2.3 转染ELF5mRNA对Ishikawa细胞增殖的影响:MTT检测结果显示，随着培养时间(24h、48h、72h)的增加，重组质粒组细胞增殖抑制率较其他两组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。而空质粒组与空白对照组比较，差异则无统计学意义(P>0.05)。

表2 转染ELF5mRNA后对子宫内膜癌Ishikawa 细胞增殖的影响±s)

*与重组质粒组比较，差异有统计学意义(P<0.05)

2.4 转染ELF5mRNA后Ishikawa细胞周期的变化:流式细胞仪检测结果显示，重组质粒组中(60.86±0.52)%的细胞阻滞于G0/G1期，分别与空质粒组(33.78±0.34)%及空白对照组(32.37±0.47)%比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。而空质粒组与空白对照组比较，差异则无统计学意义(P>0.05)。见表3，图3。

表3 转染ELF5mRNA对Ishikawa细胞周期的影响

*与重组质粒组比较，差异有统计学意义(P<0.05)

图3 转染ELF5mRNA对Ishikawa细胞周期的影响

A组：空白对照组；B组：空质粒组；C组：重组质粒组

2.6 转染ELF5mRNA后Ishikawa细胞凋亡率的变化:流式细胞仪检测结果显示：重组质粒组凋亡率(38.03±1.40)%，较空质粒组(17.07±0.28)%和空白对照组(19.27±0.55)%明显增高(P<0.05)，而空质粒组与空白对照组之间，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 转染ELF5mRNA后细胞凋亡的变化

注：A组：空白对照组；B组：空质粒组；C组：重组质粒组

2.6 转染ELF5基因后Ishikawa细胞中P21、Caspase-3蛋白表达的变化:Western blotting检测结果显示，P21、Caspase-3蛋白在重组质粒组的表达均高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 蛋白印迹法检测三组细胞中P21、Caspase-3蛋白的表达

2.7 转染ELF5mRNA后子宫内膜癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的变化:裸鼠体内瘤组织HE染色病理切片证实了子宫内膜癌细胞的致瘤性。裸鼠剖检结果亦表明，重组质粒组裸鼠体内的成瘤能力(瘤组织最大直径、重量)明显低于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。而空质粒组与空白对照组比较，差异则无统计学意义(P>0.05)。见图6，表4。

图6 子宫内膜癌移植瘤HE染色病理切片(×20)

表4 各组瘤组织最大直径、重量的比较±s，n=5)

*与重组质粒组比较，P<0.05；*两组间比较，P>0.05

2.8 转染ELF5mRNA后各组移植细胞凋亡情况:TUNEL法检测结果显示，重组质粒组细胞凋亡率明显高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。而空质粒组与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图7、表5。

图7 转染ELF5mRNA后各组移植瘤细胞凋亡病理染色图片(×200)

表5 TUNEL法检测各组移植瘤细胞凋亡的比较

2.9 转染ELF5mRNA后移植瘤组织中P21、Caspase-3蛋白表达的变化:Western blotting检测结果显示，重组质粒组移植瘤组织中蛋白P21及Caspase-3的表达明显高于空质粒组及空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图8。

图8 蛋白印迹法检测各组移植瘤组织中P21、Caspase-3蛋白的表达

3 讨 论

子宫内膜癌(EC)是最常见的妇科恶性肿瘤，是世界癌症死亡的主要原因之一[6]，占妇科恶性肿瘤总数的7%，且发病率及死亡率呈逐年上升的趋势。早期患者以手术为主，术后根据高危因素选择辅助治疗。然而对于早期有生育要求的年轻患者来说，手术并不是治疗子宫内膜癌的最佳选择。子宫内膜癌的发生涉及多基因、多步骤的复杂过程[7]，深入研究控制子宫内膜癌发生、发展过程中关键基因的作用，对子宫内膜癌的早期诊断、早期治疗及预后有重要意义。

ELF5属于Ets家族成员之一，ELF5位于人11号染色体短臂13-15区，这个区域在癌症中易发生杂合性丢失，Elf5含有两个可识别结构域，一个所有ETS转录因子都包含的能够与TTCC核心序列结合的基序和一个参与蛋白间相互作用的点结构域，ELF5的完整结构域包含参与蛋白间相互作用的结构域、与苏氨酸/半胱氨酸核心序列结合的基序及两个共性结构域。

本研究将重组质粒pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核细胞表达载体体外转染至人子宫内膜癌细胞，同时以转染空载质粒pcDNA3.1-EGFP及未经转染的人卵巢癌细胞作为对照，进一步从多方面研究ELF5基因干预对人子宫内膜癌细胞周期及凋亡的影响，并探讨其抑制癌细胞增殖及周期阻滞的可能机制。MTT检测结果显示，ELF5基因具有明显抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用。流式细胞仪检测结果表明，ELF5基因可将细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。在蛋白水平，重组质粒组细胞P21及Caspase-3的表达明显高于其它两组，表明ELF5基因可能通过上调人子宫内膜癌干细胞P21及Caspase-3的表达而影响细胞周期及凋亡。本研究裸鼠移植瘤体内实验，进一步探讨了ELF5基因对子宫内膜癌细胞周期及凋亡的影响。结果显示，重组质粒组裸鼠体内的成瘤能力明显低于其它两组，表明ELF5mRNA在体内也可抑制子宫内膜癌细胞的生长。TUNEL检测结果显示，重组质粒组裸鼠体内的细胞凋亡率高于其它两组，表明ELF5基因在体内也具有明显的促肿瘤细胞凋亡作用。蛋白水平显示，重组质粒组裸鼠体内瘤组织P21及Caspase-3的表达明显高于其它两组，表明ELF5基因在体内也可通过上调人子宫内膜癌细胞P21及Caspase-3的表达而影响细胞周期及凋亡。

本实验研究结果证实，ELF5mRNA对子宫内膜癌增殖及周期有明显影响，其机制可能与P21及Caspase-3有关。ELF5mRNA在子宫内膜癌的发生发展中起着重要作用，这使得ELF5mRNA今后可能成为子宫内膜癌基因治疗的新靶点，这对降低子宫内膜癌的病死率有着极其重要的意义。

[1] Gu HQ,Zhang ZB,et al. The role of the SDF-1/CXCR7 axis on the growth and invasion ability of endometrial cancer cells[J].Arch Gynecol Obstet,2017,17:4308.

[2] Chou WC,Lee PH,Tan YY,et al.An integrative transcriptomic analysis revealsbisphenol A exposure-induced dysregulation of microRNA expression inhuman endometrial cells[J].Toxicol in Vitro,2017, 2:12.

[3] Frend HT, Watson CJ.ELF5-breast cancer's little helper[J].Breast Cancer Res,2013,15(2):307.

[4] 钱卫卫，闫洪超.ELF5mRNA在卵巢上皮性癌组织中的表达及临床意义[J].中国煤炭工业医学杂志,18(12):2009～2012.

[5] 仇影影,谢肖磊等.转染ELF5基因的人卵巢癌干细胞增殖、侵袭能力及凋亡变化[J].山东医药,2016,56(19):25～27.

[6] Yang S, Thiel KW, Leslie KK. Progesterone: the ultimate endometrial tumor suppressor[J].Trends Endocrinol Metab, 2011, 22(4): 145～152.

[7] Arem H, Park Y, Pelser C, et al.Prediagnosis body mass index, physical activity and mortality in endometrial cancer patients[J].Jnci Natl Cancer Inst, 2013, 105 (5) : 342～349.

Effect of Transfection of ELF5 mRNA on Apoptosis and Cycle of Endometrial Carcinoma Cells

QITing,etal

(GraduateSchoolofXuzhouMedicalUniversity,JiangsuXuzhou221000,China)

Objective:To study the effects of ELF5 gene on cycles and apoptosis of human endometria cancer cells and its probable mechanism. Methods: The eukaryotic expression vectedical or pcDNA3.1-ELF5+EGFP was transfected into human endometria cancer cells in vitro (recombinant plasmid group), and positive cell clones were selected by G418 and amplified. Transfected pcDNA3.1-EGFP cells (empty plasmid group) and untransfected cells (blank control group) were served as control groups. In vitro, the cell prolifetraion ability of three groups was analyzed by MTT; the cycle and apoptosis was analyzed by flow cytometry; the expression of protein P21 and Caspase-3 was detected by Western blot. In vivo, three groups of cells were transplanted into NOD/SCID nude mice, and observed the growth ability of tumors; the apoptosis of tumors was determined by TUNEL; the expression of protein P21 and Caspase-3 in tumors was detected by Western blot. Results: The recombinant plasmid pcDNA3.1- ELF5+EGFP was successfully transfected into human endometria cancer cells; The expression of ELF5 mRNA in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05); At each time point, the cell proliferation ability of the recombinant plasmid group was significantly decreased than that of the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The number of cells arrested in G0/G1phase of the recombinant plasmid group was higher than that of the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The apoptosis rate of the recombinant plasmid group was compared with the empty plasmid group and the blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The expression of protein P21 and Caspase-3 in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05). In vivo, the growth ability of tumors (maximum diameter, weight) in recombinant plasmid group was lower than that in the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); In vivo, the apoptosis rate of the recombinant plasmid group was compared with the empty plasmid group and the blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); In vivo, the expression of protein P21 and Caspase-3 in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05). Conclusions: ELF5 gene has obvious effects on cycles and apoptosis of human endometria cancer cells and its mechanism connected with the protein P21 and Caspase-3.

ELF5 gene; Endometria cancer cells; Transfection; Cell cycles; P21; Caspase-3; Apoptosis

1006-6233(2017)06-0889-06

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.04

*【通讯作者】闫洪超