优化石菖蒲组份配伍对谷氨酸致PC12细胞损伤的保护作用

钟言 曾志杰 龚玉滢 陈晓燕 陈云波 魏刚 程淑意 周莹

优化石菖蒲组份配伍对谷氨酸致PC12细胞损伤的保护作用

钟言 曾志杰 龚玉滢 陈晓燕 陈云波 魏刚 程淑意 周莹

目的 探讨优化石菖蒲组份配伍对谷氨酸致PC12细胞损伤的保护作用。方法 对PC12细胞进行体外培养,使用的模型是谷氨酸促使PC12细胞出现损伤,将其分成β-细辛醚、丁香酚不同浓度配伍组及β-细辛醚单体组、丁香酚单体组、谷氨酸损伤模型组、正常对照组进行筛选试验,对损伤PC12细胞活力(OD值)变化情况进行测算,使谷氨酸促使PC12细胞出现损伤保护作用的丁香酚配伍与β-细辛醚的最佳配比进行有效的筛选。结果 取最低浓度考虑β-细辛醚单体和丁香酚单体的起效浓度分别为49 μmol/L和14 μmol/L。本次结果显示细胞OD值9 μmol/L∶14 μmol/L组>9 μmol/L∶2 μmol/L组>49 μmol/L∶0.5 μmol/L组>49 μmol/L∶14 μmol/L组>9 μmol/L∶0.5 μmol/L组>1.9 μmol/L∶14 μmol/L组>49 μmol/L∶2 μmol/L组>正常对照组>β-细辛醚单体组>1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L组>1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L组>丁香酚单体组>谷氨酸损伤模型组,OD值分别为(1.88±0.04)、(1.80±0.05)、(1.80±0.03)、(1.79±0.07)、(1.79±0.02)、(1.78±0.03)、(1.76±0.05)、(1.72±0.07)、(1.72±0.06)、(1.72±0.04)、(1.71±0.03)、(1.68±0.08)、(1.65±0.05)。除丁香酚单体组,其余各组OD值与谷氨酸损伤模型组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 β-细辛醚与丁香酚配伍对谷氨酸致PC12细胞损伤保护作用的较佳的浓度配比可能在9 μmol/L∶0.5 μmol/L～9 μmol/L∶2 μmol/L之间。

β-细辛醚；丁香酚；谷氨酸；PC12细胞；优化

β-细辛醚和丁香酚是从中药石菖蒲中提取的两种主要有效成份,阿尔茨海默病(AD)是与谷氨酸密切相关的神经退行性疾病,且呈缓慢进行性发展［1-3］,神经细胞突触中的谷氨酸可急剧增多,一般出现在缺氧、缺血、创伤和昏厥,严重可导致神经细胞死亡,有研究表明,石菖蒲中的β-细辛醚和丁香酚对神经细胞的退变可起到保护的作用。为了研究通过中药组份配伍而达到减毒、增效的目的,本研究通过优化β-细辛醚和丁香酚的浓度配比,从而筛选出对谷氨酸致PC12细胞损伤保护作用的较佳的浓度配比。

1 材料与方法

1.1 试剂及其配制、细胞株、仪器 上海同仁试剂公司提供的CCK8试剂盒；HyClone公司提供的马血清,GIBCO公司提供的特级胎牛血清,GIBCO公司提供的高糖DMEM培养基,GIBCO公司提供的胰蛋白酶,其浓度为0.25%,GIBCO公司提供的DPBS缓冲液,广州中医药大学新药研究开发中心提供的β-细辛醚、丁香酚单体(各1 mmol/L,保存于4℃的冰箱中),北京鼎国生物技术发展中心提供的L-谷氨酸、低分化PC12细胞。TECAN DNA Expert提供的酶标仪,德国Binder CB150提供的CO2培养箱。采用高糖DMEM培养基分别配制2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和40 mmol/L的L-谷氨酸,并保存于4℃的冰箱中备用。PC12细胞的传代培养在CO2培养箱进行,而其需生长在83%高糖DMEM培养基、8%特级胎牛血清和8%马血清中,体积分数为5,培养温度控制在37℃。每隔3 d更换1次培养液,直到细胞呈对数增长,稀释细胞至1×105/ml并加入到96孔板中,每孔为100 μl。

1.2 研究方法

1.2.1 对PC12细胞谷氨酸损伤模型进行创建 PC12细胞生长出现贴壁时,且交叉成网时,采用DPBS进行荡洗,然后弃培养基,随机分成五组,每组10孔,谷氨酸组加入含有不同浓度谷氨酸的DMEM培养基,正常对照组则向每孔加入高糖DMEM培养基100 μl,在培养16、24、32、48 h时观察细胞形态的变化,然后再加入CCK8稀释液,每孔为20 μl。于90 min后测定其450 nm处的OD值,其中较好的造模浓度和时间分别为10 mmol/L和16 h。

1.2.2 筛选单体、配伍浓度 江湧等［4］研究结果显示,β-细辛醚单体的起效浓度为50 μmol/L,而丁香酚单体的起效浓度为15 μmol/L。参照上述研究的单体起效浓度,设置β-细辛醚单体4个组,其浓度分别为200、100、50、25 μmol/L；设置丁香酚单体4个组,其浓度分别为60、30、15、7.5 μmol/L。两单体的起效浓度以5倍的比例进行减小,配伍组按照两两配对的标准。对β-细辛醚进行单独设置：丁香酚包括9个配伍组,即1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L、1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L、1.9 μmol/L∶14 μmol/L、9 μmol/L∶0.5 μmol/L、9 μmol/L∶2 μmol/L、9 μmol/L∶14 μmol/L、49 μmol/L∶0.5 μmol/L、49 μmol/L∶2 μmol/L和49 μmol/L∶14 μmol/L。每组都进行预给药,将时间记录好,4 h后将谷氨酸加入其中,谷氨酸浓度为9 mmol/L,接着再培养16 h,最后采用CCK8法检测OD值。对细胞形态学的变化情况进行认真观察,筛选诱导PC12细胞损伤保护作用的谷氨酸最佳浓度配伍比。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示,CCK8法测OD值均采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

取最低浓度考虑β-细辛醚单体和丁香酚单体的起效浓度分别为49 μmol/L和14 μmol/L。本次结果显示细胞OD值9 μmol/L∶14 μmol/L组>9 μmol/L∶2 μmol/L组>49 μmol/L∶0.5 μmol/L组>49 μmol/L∶14 μmol/L组>9 μmol/L∶0.5 μmol/L组>1.9 μmol/L∶14 μmol/L组>49 μmol/L∶2 μmol/L组>正常对照组>β-细辛醚单体组>1.9 μmol/L∶2.9 μmol/L组>1.9 μmol/L∶0.5 μmol/L组>丁香酚单体组>谷氨酸损伤模型组,OD值分别为(1.88±0.04)、(1.80±0.05)、(1.80±0.03)、(1.79±0.07)、(1.79±0.02)、(1.78±0.03)、(1.76±0.05)、(1.72±0.07)、(1.72±0.06)、(1.72±0.04)、(1.71±0.03)、(1.68±0.08)、(1.65±0.05)。除丁香酚单体组,其余各组OD值与谷氨酸损伤模型组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度配伍比例及β-细辛醚单体、丁香酚单体对PC12细胞OD值的影响(±s)

表1 不同浓度配伍比例及β-细辛醚单体、丁香酚单体对PC12细胞OD值的影响(±s)

注：与谷氨酸损伤模型组比较,aP<0.05

组别 比例数 OD值1.9 μmol/L:0.5 μmol/L组 7 1.71±0.03a1.9 μmol/L:2.9 μmol/L组 7 1.72±0.04a1.9 μmol/L:14 μmol/L组 7 1.78±0.03a9 μmol/L:0.5 μmol/L组 7 1.79±0.02a9 μmol/L:2 μmol/L组 7 1.80±0.05a9 μmol/L:14 μmol/L组 7 1.88±0.04a49 μmol/L:0.5 μmol/L组 7 1.80±0.03a49 μmol/L:2 μmol/L组 7 1.76±0.05a49 μmol/L:14 μmol/L组 7 1.79±0.07aβ-细辛醚单体组 9 1.72±0.06a丁香酚单体组 9 1.68±0.08谷氨酸损伤模型组 9 1.65±0.05正常对照组 9 1.72±0.07a

3 小结

具有神经元特性的PC12细胞为国际公认的可模拟神经细胞功能的细胞,主要来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤,而过量的谷氨酸会对其造成损伤［5-8］。已有研究者［9］建立Aβ1-40诱导PC12细胞死亡这一模型,并证实了起到保护作用的为丁香酚和β-细辛醚这两种成分,其皆取自中药石菖蒲,钙拮抗作用及稳定细胞线粒体膜电位可能为其作用机制。本研究结果表明β-细辛醚与丁香酚的配比浓度为9 μmol/L∶2 μmol/L的配伍组合,能在1/5的单体剂量下发挥保护作用,作用显著。多成份的综合作用体现中药的疗效,与单体进行配伍组合以及筛选会发挥较好的减毒作用。

［1］陈奕芝,方永奇,梁毅,等.β-细辛醚对谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用.中国中医药信息杂志,2007,14(6):22-23.

［2］陈奕芝,王绮雯,梁毅,等.β-细辛醚对谷氨酸所致脑皮层神经元损伤的保护作用.中药材,2007,30(4):436-439.

［3］江湧,方永奇,何玉萍.石菖蒲有效成分配伍对Aβ损伤PC12细胞的保护作用.中药新药与临床药理,2006,17(5):335-338.

［4］江湧,方永奇,魏刚,等.优选细辛醚组合对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用.湖北中医药大学学报,2007,9(1):15-17.

［5］Biagas K.Hypoxic-ischemic brain injury: advancements in the understanding of mechanisms and potential avenues for therapy.Current Opinion in Pediatrics,1999,11(3):223-228.

［6］虞希冲,朱桐君.谷氨酸转运体、谷氨酸/胱氨酸转运体与谷氨酸神经细胞毒作用.中国临床药理学与治疗学,2003,8(5):490-493.

［7］谢振华,刘长振,王爱民,等.PC12细胞中氧化还原因子-1对过氧化氢和谷氨酸损伤的不同反应.毒理学杂志,2007,21(4): 245-247.

［8］陈奕芝,方永奇,梁毅,等.β-细辛醚对谷氨酸诱导损伤的脑皮层神经元凋亡线粒体膜电位和超微结构的影响.卒中与神经疾病,2007,14(5):263-266.

［9］Irie Y,Keung WM.Rhizoma acori graminei and its active principles protect PC12 cells from the toxic effect of amyloid-β peptide.Brain Research,2003,963(1-2):282.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.06.098

2017-01-19］

国家科技重大专项(重大新药创制)项目(项目编号：2009ZX09103-429),2010年广州中医药大学本科生创新实验项目

510405 广州中医药大学第二临床医学院(钟言曾志杰 龚玉滢 陈晓燕)；广州中医药大学临床药理研究所DME中心(陈云波 程淑意 周莹)；广州中医药大学新药开发研究中心(魏刚)

陈云波