HPLC法测定鱼肝油软膏中全反式维生素A醋酸酯的含量

蔡 乐，白 林，范金钊，任 韡，黄晓舞

（解放军总医院药学部，北京 100853）

·实验研究·

HPLC法测定鱼肝油软膏中全反式维生素A醋酸酯的含量

蔡 乐，白 林，范金钊，任 韡，黄晓舞

（解放军总医院药学部，北京 100853）

目的：建立HPLC法测定鱼肝油软膏中全反式维生素A醋酸酯的含量。方法：采用超声提取方法处理鱼肝油软膏，用HPLC法进行含量测定。色谱柱为Platisil ODS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（98 : 2），流速：1.0 mL·min-1，检测波长：328 nm，柱温：30 ℃。结果：维生素A在0.587 9 ～ 7.348 5 U·mL-1范围内线性关系良好（r = 0.999 9）；样品平均回收率为99.78%（RSD = 1.57%）。结论：本方法简便、准确、重复性好，可用于鱼肝油软膏中全反式维生素A醋酸酯的含量测定。

鱼肝油软膏；维生素A醋酸酯；高效液相色谱法；含量测定

鱼肝油软膏为《解放军医疗机构制剂规范》（2015年版）中收载的皮肤科外用制剂，由鱼肝油和凡士林组成，具有营养、保护、润滑及促进肉芽组织生长等作用，有助于伤口、烧伤及各种溃疡的愈合。临床中可用于慢性皮肤结核、皲裂、鱼鳞病、皮肤干燥、外伤、烧烫伤、溃疡及子宫颈炎等[1]。鱼肝油主要含有维生素A类和维生素D类脂溶性维生素[2-3]，维生素A有多种分子形式，人工合成的维生素A主要为维生素A醋酸酯，其中全反式维生素A醋酸酯为活性成分，为控制鱼肝油软膏的质量，本研究建立了HPLC方法测定鱼肝油软膏中全反式维生素A醋酸酯的含量。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括1200系列在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、色谱工作站，美国Agilent公司）；AG-285型电子天平（瑞士Mettler公司）。

鱼肝油软膏（本院自制，规格1 0%，批号20161025，20161101，20161108）；维生素A醋酸酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100368-201301，每1 g中含维生素A醋酸酯343 mg，其中含全反式维生素A醋酸酯96.9%）；甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Platisil ODS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（98 : 2）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：328 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称定维生素A醋酸酯1.014 1 g，置于100 mL棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液A。精密移取储备液A 1 mL置于50 mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为储备液B。精密移取储备液B 1.5 mL置于100 mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含相当于维生素A为2.939 4 U的对照品溶液（1 U维生素A = 0.344 μg全反式维生素A醋酸酯）。

2.2.2 供试品溶液 避光操作，取供试品适量（约相当于含鱼肝油0.25 g），精密称定，置于50 mL棕色量瓶中，加无水乙醇约30 mL，于50 ℃水浴加热超声10 min，放至室温，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，置于冰浴中冷却1 h，取出后迅速滤过，放至室温，精密量取续滤液4 mL，置10 mL棕色量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 另按处方比例及制备工艺，配制不含鱼肝油的空白制剂，依“2.2.2”项下方法处理，制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按“2.1”项下色谱条件，各进样10 μL，测定HPLC图谱，考察供试品中全反式维生素A醋酸酯和其他组分色谱峰分离情况。在此色谱条件下，全反式维生素A醋酸酯的保留时间约为10.0 min，全反式维生素A醋酸酯色谱峰峰形对称尖锐，基线平稳，与其他色谱峰分离良好，阴性样品无干扰。具体见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取适量对照品储备液，加流动相配制成含全反式维生素A醋酸酯浓度为0.587 9，1.469 7，2.939 4，4.409 1，5.878 8，7.348 5 U·mL-1的溶液。分别精密吸取各浓度溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标（Y），标准溶液浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得全反式维生素A醋酸酯的回归方程为Y = 32.104 X + 0.798 2，r = 0.999 9。结果表明，全反式维生素A醋酸酯在0.587 9 ～ 7.348 5 U·mL-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验

取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”色谱条件下，连续进样6次测定，计算全反式维生素A醋酸酯的峰面积RSD（n = 6）为0.35%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一供试品（批号20161101）约2.5 g，共6份，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下测定，计算含量RSD为2.09%（n = 6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性考察

图1 鱼肝油软膏的HPLC色谱图A – 对照品溶液，B – 供试品溶液，C – 阴性对照溶液；1 – 全反式维生素A醋酸酯Fig 1 HPLC chromatograms of cod liver oil ointmentA – reference solution, B – test solution, C – negative reference solution; 1 – all-trans vitamin A acetate

取同一供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下，分别于0、1、2、4、6、8 h进样10 μL测定，计算全反式维生素A醋酸酯的峰面积RSD为1.23%（n = 6），表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.8 加样回收率实验

取“2.2.3”项下空白制剂9份，分成3组，每组3份，每份约2.5 g。分别精密加入一定量的对照品储备液，按供试品溶液制备方法制成含量约为供试品标示量的80%、100%和120%的样品溶液。依“2.1”色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3批样品（批号20161025、20161101、20161108），每批样品测定3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下测定，以外标法计算各个样品中全反式维生素A醋酸酯的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 质控指标的选择

鱼肝油是从无毒海鱼肝脏中提取出并经适当工艺制成的一种脂肪油制剂，主要含有维生素A和维生素D。维生素A是调节上皮细胞分化生长的辅助因子，可催化黏多糖的合成以及维持上皮组织结构的完整性。维生素D也对维持上皮细胞功能具有一定的作用[4]。本研究曾考虑将维生素A和维生素D均作为鱼肝油软膏的质量控制指标，但经查阅文献[5]和实验发现，该制剂中维生素D含量较低（15 U·g-1），采用该方法测定时不可检出，故只选用维生素A作为鱼肝油软膏的质控指标。《中国药典》2015年版中维生素A的含量以单位（U）表示，因此本研究将反式维生素A醋酸酯的含量折算为单位标示。

表1 回收率实验结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

表2 鱼肝油软膏中全反式维生素A醋酸酯的含量. n = 3Tab 2 Determination of contents of all-trans vitamin A acetate in cod liver oil ointment. n = 3

3.2 样品处理方法的优化

本研究对样品的提取溶剂进行考察，发现无水乙醇的提取率明显高于流动相。为减小供试品溶液对色谱柱的损害，本研究在样品提取后，先在冰浴条件下使部分辅料沉淀，滤过后再加入流动相进一步使辅料沉淀，最后用0.22 μm微孔滤膜滤过后进样[6]。试验发现，50 ℃水浴时充分振摇可完全提取样品，因50 ℃超声提取方法相对简便且重现性更好，为此采用50 ℃下超声处理作为提取方法。

3.3 含量范围的确定

参考《中国药典》2015年版，每1 g鱼肝油应含维生素A 1350 ～ 1800 U（标示量的90.0% ～ 120.0%），设定鱼肝油软膏允许的投料范围为90.0% ～ 110.0%，每1 g 10%鱼肝油软膏应含维生素A 121.5 ～ 198 U，即标示量的81% ～ 132%。为提高自制制剂的标准，本研究将自制制剂的内控标准设定为标示量的85% ～ 125%。

结果表明，本方法操作简便，准确性高，重复性好，可作为鱼肝油软膏中全反式维生素A醋酸酯含量测定的方法。

[1] 中央军委后勤保障部卫生局.中国人民解放军医疗机构制剂规范（第一册）[S].2015年版.北京：人民军医出版社，2016：191-192. [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：686.

[3] 牛剑钊，黄海伟，张启明.《中国药典》2010年版鱼肝油质量标准问题的探讨和建议[J].中国药品标准，2013，15（3）：163-164. [4] 廖二元.维生素D制剂的药理机制与临床应用[J].中南药学，2003，1（2）：98-102.

[5] 冯国.反相高效液相色谱法测定维D2磷酸氢钙片中维生素D2的含量[J].中国药业，2013，22（12）：91-92.

[6] 蔡乐，白林，徐风华，等.HPLC法测定薄荷苯酚软膏中苯酚的含量[J].中国药物应用与监测，2014，11（2）：82-84.

Determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment by HPLC

CAI Le, BAI Lin, FAN Jin-zhao, REN Wei, HUANG Xiao-wu(Pharmaceutical Department of PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective: To establish the HPLC method for determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment. Methods: The Vitamin A acetate in ointment was extracted by ultrasonic method, and the content of all-trans Vitamin A acetate was determinated by HPLC method. HPLC was carried out on a column of Platisil ODS C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with mobile phase consisting of methanol-water (98 : 2). The fl ow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 328 nm. The column temperature was 30 ℃. Results: Vitamin A showed a good linear relationship in the range of 0.587 9 – 7.348 5 U·mL-1(r = 0.999 9). The average recovery was 99.78% (RSD = 1.57%). Conclusion: The method is simple, accurate and repeatable, which is suitable for the content determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment.

Cod liver oil ointment; Vitamin A acetate; HPLC; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)03 – 0143 – 03

2016-11-22

2017-03-13）

解放军总医院临床扶持基金（2012FC-CXYY-4008）

黄晓舞，女，副主任药师，研究方向：药物制剂与药品质量控制。E-mail：huangxw301@163.com

蔡乐，男，副主任药师，研究方向：医院药学、药物分析。E-mail：caile15009@163.com