β—胡萝卜素发酵促进因子筛选及均匀试验设计优化

杨晔 尹金凤 李泓全

摘要[目的]提高三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的能力。[方法]对6种发酵促进剂的添加浓度及其交互作用进行系统的研究。通过单因素试验考察确定了各发酵促进剂的最适添加浓度范围，在此基础上，运用均匀设计对组合配方优化。[结果]当发酵过程中添加0.4 mmol/L MgCl2、20.0 μmol/L H2O2、0.1% Span 20、1.8 %正癸烷、0.2 mmol/L甲酸钠以及1.1 g/L柠檬酸三钠时，β-胡萝卜素产量可达到2.27 g/L，较对照组提高了77.30%。[结论]经过优化后的发酵促进剂组合配方能够显著提高三孢布拉霉产β-胡萝卜素的能力。

关键词β-胡萝卜素；发酵促进剂；单因素试验；均匀试验设计

中图分类号TS201.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0077-03

Abstract[Objective] In order to improve the fermentative production of βcarotene by Blakeslea trispora.[Method] The dosage concentration and interactions of 6 fermentation accelerants were studied.Firstly，using single factor experiments to study the effective concentration range of fermentation accelerants.Then on this basis，by using uniform experiment to optimize the fermentation culture.[Result] The optimal fermentation accelerant formula was composed of 0.4 mmol/L MgCl2，20.0 μmol/L H2O2，0.1% Span 20，1.8% ndecane，0.2 mmol/L sodium formate and 1.1 g/L trisodium citrate.The βcarotene production was up to 2.27 g/L，77.30% higher than that of control group.[Conclusion] The optimized fermentation accelerants could significantly improve the βcarotene production.

Key wordsβcarotene；Fermentation accelerant；Single factor experiment；Uniform experimental design

β-胡蘿卜素屬于类胡萝卜素的一种，是高度不饱和的萜类化合物。该化合物具有优良的抗氧化特性，较强的着色性能，并可以作为维生素A的前体，在食品和饲料添加剂、化妆品、营养保健品及医药等行业具有广阔的应用前景[1]。目前市场上β-胡萝卜素主要来源于化学合成，但由于存在有害物质残留等问题，限制了其应用。天然β-胡萝卜素由于其良好的生理活性、更好的食药安全性以及较高的生物利用度，因而具有极其广阔的发展空间[2]。其中，利用微生物发酵生产天然β-胡萝卜素，由于其生产过程经济性以及不易受外界环境约束等优势，因而成为大规模制备天然β-胡萝卜素的主要手段[3-4]。

三孢布拉霉作为天然β-胡萝卜素的主要生产菌株，其发酵生产工艺改进一直是目前研究的热点[5]。β-胡萝卜素为次级代谢产物，产能依赖于三孢布拉霉菌体的大量繁殖和体内积累。笔者通过加入一些发酵促进剂来改善三孢布拉霉的发酵产能，通过调控生物合成途径中关键酶的活性，从而达到提高β-胡萝卜素产量的目的。首先选取部分发酵促进剂进行单因素考察，在此基础上，通过均匀设计对发酵促进因子的组合使用浓度进行了优化，得到发酵促进剂的最佳配方组合。

1材料与方法

1.1材料三孢布拉霉（Blakeslea trispora）正菌SRICI-H5-30和负菌SRICI -H6-1，上海化工研究院菌种室保存。β-胡萝卜素标准品，百灵威科技有限公司；叔丁基-4-羟基茴香醚（98%，B103750），上海晶纯生化科技股份有限公司；其余化学试剂皆为国产分析纯。

1.2培养基种子培养基组分为玉米粉80.0 g/L，黄豆饼粉28.0 g/L。

发酵液培养基组分为玉米淀粉80.0 g/L，黄豆饼粉16.0 g/L，酵母膏2.0 g/L，异烟肼0.4 g/L，KH2PO4 0.6 g/L，MnSO4·H2O 0.3 g/L，Triton 1.2 g/L，煤油2.4%，玉米油 6.6%。

补液培养基组分为蔗糖200.0 g/L，蛋白胨4.2 g/L，酵母膏2.0 g/L，MgCl2 1.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，KCl 1.0 g/L，叔丁基-4-羟基茴香醚0.3 g/L。诱导剂为溶解于煤油的β-紫罗兰酮溶液（8.1%，V/V）。

1.3培养条件按照文献[6]所述方法，将三孢布拉霉菌正、负菌孢子接种至种子培养基，并于27 ℃、230 r/min培养24 h。随后以10%（V/V）接种量将种子液转接于发酵培养基中，并于27 ℃、230 r/min培养120 h。当发酵至51 h时，添加补液2.5 mL，并添加β-紫罗兰酮诱导剂1.0 mL；发酵至96 h时，添加补液2.5 mL。

1.4β-胡萝卜素提取及测定三孢布拉氏霉β-胡萝卜素的提取和含量分析按照文献[6]所述方法进行。

1.5发酵促进剂单因素考察该研究所考察的各类发酵促进因子，除表面活性剂类化合物Span 20按照一定浓度预先添加于发酵培养基中，其余发酵促进剂MgCl2、H2O2、正癸烷、甲酸钠、柠檬酸三钠按照所需浓度配制成溶液并以等体积溶媒为对照，于51 h添加于发酵培养基中，考察不同浓度的发酵促进剂对发酵产量的影响。具体发酵促进剂单因素试验水平如下：Span 20，0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%；MgCl2，0、0.30、0.60、0.90、1.10 mmol/L；H2O2，0、30、90、150、300 μmol/L；正癸烷，0、0.6%、1.2%、1.8%、2.7%、3.6%；甲酸钠0、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8 mmol/L；柠檬酸三钠0、0.45、0.75、1.20、1.60、2.00 g/L。

1.6发酵促进剂均匀设计试验根据单因素试验所筛选的各发酵促进剂最优添加浓度，按照6因素12水平U*12（1210）进行均匀试验设计，考察6种发酵促进剂对三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的协同作用。

2结果与分析

2.1发酵促进剂的单因素筛选及其对β-胡萝卜素发酵产能的影响该研究前期工作从表面活性剂、金属离子、氧载体、烷烃类、有机酸和中间代谢产物6类35个化合物中筛选得到6个对三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素具有促进作用的发酵促进因子，分别为Span 20、MgCl2、H2O2、正癸烷、甲酸钠、柠檬酸三钠。对6种发酵促进剂进行单因素考察，确定最适添加浓度。

2.1.1Span 20对发酵产能的影响。由图1可知，添加Span 20对β-胡萝卜素的产量有一定的影响。少量添加Span 20对其产量有少量提升作用，而且Span 20的添加极大地减少了发酵液中的泡沫产生，有利于放大试验发酵。当添加量大于0.1%之后，β-胡萝卜素的含量出现了显著下降。这可能是由于发酵液中已经含有1.2 g/L 的表面活性剂Triton，大量的表面活性剂对微生物菌体具有一定的毒性，从而影响的β-胡萝卜素的生物合成[7]。

2.1.2MgCl2对发酵产能的影响。发酵进行51 h时，向发酵液中分别添加不同浓度的MgCl2，β-胡萝卜素含量有较大提高。由图2可以看出，当MgCl2的浓度达到0.6 mmol/L时，β-胡萝卜素的产量达到最大为1.382 g/L，比对照组提高了18%。超过此浓度，对β-胡萝卜素产量的进一步提高并不明显。

2.1.3H2O2对发酵产能的影响。三孢布拉霉作为严格好氧菌株，在发酵过程中需要大量的氧气，添加一定量的H2O2对β-胡萝卜素的产量有一定促进作用。从图3可知，在H2O2浓度为30 μmol/L时β-胡萝卜素的含量达到最大为1.34 g/L，超过此浓度后，β-胡萝卜素含量出现下降。这可能是由于过量的H2O2对细胞产生过氧化作用，破坏了细胞膜，进而影响了细胞的代谢能力。

2.1.4正癸烷对发酵产能的影响。从图4中可以看出，随着正癸烷浓度的增加，β-胡萝卜素的产量也随着提高，当正癸烷浓度为1.8%时，β-胡萝卜素产量达到1.908 g/L，比对照组提高了67.8%。这可能是由于正癸烷的添加使发酵液形成了一种双液相发酵系统[8]，提高了发酵液的溶氧能力，改善了传质性能，大大地促进了三孢布拉霉产β-胡萝卜素的能力。

2.1.5甲酸钠对发酵产能的影响。从图5中可以看出，随着甲酸钠浓度的增加，β-胡萝卜素的产量出现了先上升后下降的趋势。当甲酸钠浓度为0.8 mmol/L时，β-胡萝卜素产量达到1.721 g/L，随后逐渐趋缓，当甲酸钠浓度为1.6 mmol/L时，β-胡萝卜素产量达到最大，为1.732 g/L，与对照组相比β-胡萝卜素的产量提高了7.70%。继续提高甲酸钠的浓度，β-胡萝卜素产量出现下降，说明高浓度的甲酸钠不利于三孢布拉霉菌体合成β-胡萝卜素。

2.1.6柠檬酸三钠对发酵产能的影响。从图6中可以看出，随着柠檬酸三钠浓度的增加，β-胡萝卜素的产量出现了先上升后下降的趋势，当柠檬酸三钠浓度为0.75 g//L时，β-胡萝卜素产量达到最高为1.682 g/L，三羧酸循环中部分中间代谢产物可以为β-胡萝卜素的合成提供碳骨架结构，也可以促进三孢布拉霉菌的生长及产色素的过程。继续提高柠檬酸三钠的浓度，β-胡萝卜素产量出现显著下降，高浓度的柠檬酸三钠不利于三孢布拉霉菌体合成β-胡萝卜素。

由图1～6分析可知，6种化合物对三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素都具有一定促进作用，其中正癸烷促进效果最佳。当发酵培养基添加1.8%的正癸烷时，β-胡萝卜素产量提高67.80%。烷烃作为氧载体可有效促进发酵液的溶氧水平，继而有效提高三孢布拉霉菌发酵生产类胡萝卜素的能力。

2.2均匀试验设计优化β-胡萝卜素发酵促进因子根据上述6种发酵促进剂对β-胡萝卜素发酵水平单因素考察试验结果，按照6因素12水平U*12（1210）进行均匀试验设计，其中各促进剂试验水平详见表2所示。

对表2直观分析可以看出，对照组发酵产量1.28 g/L，4号和5号试验组发酵结果低于对照组，9号试验组的配方所得的产量最高，达到2.27 g/L比对照组提高约77.30%。9号发酵促进剂配方如下：0.1% Span 20、0.4 mmol/L MgCl2、20.0 μmol/L H2O2、1.8%正癸烷、0.2 mmol/L甲酸钠、1.1 g/L柠檬酸三钠。

3结论

通過合理的试验设计，考察6种发酵促进因子对三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的影响，首先对每种发酵促进剂进行单因素考察，其最优结果为：0.1% Span 20、0.6 mmol/L MgCl2、30 μmol/L H2O2、1.8%正癸烷、1.6 mmol/L甲酸三钠、0.75 g/L柠檬酸三钠。其中正癸烷的添加使β-胡萝卜素的产量提高了67.80%。随后采用均匀试验设计，对6种发酵促进剂的交互作用进行考察，当MgCl2的添加量为0.4 mmol/L、H2O2为20.0 μmol/L、Span 20为0.1%、正癸烷为1.8 g/L、甲酸钠为0.2 mmol/L、柠檬酸三钠为1.1 g/L时，可使β-胡萝卜素的产量高达2.27 g/L，较对照组产量1.25 g/L提高了77.30%。添加优化后的发酵促进剂组合配方能显著地提高三孢布拉霉产β-胡萝卜素的能力。

参考文献

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