南山茶籽中新发现的一个乙酰基黄酮苷的核磁结构解析

曹清明

兰 芳1

王蔚婕1

包莉圆1

钟海雁1,2

(1. 中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2. 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004)

南山茶籽中新发现的一个乙酰基黄酮苷的核磁结构解析

曹清明1,2

兰 芳1

王蔚婕1

包莉圆1

钟海雁1,2

(1. 中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2. 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004)

以南山茶籽为原料，利用溶剂提取法、液液分离、硅胶层析、高效液相半制备色谱等手段提取分离得到了一个高纯度的化合物，通过理化性质、质谱和核磁鉴定该化合物为乙酰基黄酮苷类化合物山奈酚-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1-3)-2,4-di-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1-6)]-β-D-葡萄糖苷。运用H-H COSY、HSQC、HMBC和TOCSY等二维核磁共振(2D-NMR)技术对其1H和13C NMR数据进行了全归属和详细解析。

2D-NMR；南山茶；乙酰基黄酮苷；结构解析

油茶是世界四大木本油料作物之一，作为一种天然的高级油料，其种子含油30%左右[1-3]，可用来榨油，即茶油。茶油中不饱和脂肪酸的含量高达90%[4-5]，其脂肪酸组成与橄榄油极为接近[6-7]，被誉为“东方橄榄油”。中国政府高度重视油茶产业，激发了人们对油茶籽[8-9]、油茶叶[10-11]、油茶果皮[12-16]、油茶种质资源[17-18]等方面的研究。油茶的黄酮类化合物具有猝灭自由基[19]、降脂[15, 20]、防骨质疏松[21]、抗炎[22]等作用。油茶的研究开展至今，对于现在文献报道的一些化合物，从Sigma公司等试剂公司都买不到标品，各实验室在开展试验时都需要临时制备标准品，难度大，费用高，影响了研究工作的开展。

南山茶(CamelliasemiserrataChi.)又叫做广宁红花油茶、广宁油茶、华南红花油茶等，属于山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)山茶亚属的红山茶组[23]，为多年生乔木或灌木。主要分布在中国的广西东南部以及广东西部[24-25]。本研究以南山茶饼为原料，旨在分析乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的化学成分，为研究活性与成分及其量效关系打下基础。

核磁共振联用技术可用于化合物的结构鉴定。近年来NMR技术应用于天然产物分析已日趋广泛和成熟。与一维相比，二维核磁共振谱能将化学位移、耦合常数等核磁共振参数呈现在二维平面上，能够得到自旋核之间相互作用的信息，分子结构和分子间的关系表现得更加清晰，极大地方便了核磁共振的谱图解析。课题组前期报道[26]以南山茶籽为原料，利用高效液相半制备得到了5个高纯度化合物，本试验拟利用2D-NMR研究化合物4的结构，并对其1H和13C化学位移信号进行全归属分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

油茶籽：广西藤县红羽油茶发展有限公司，经中南林业科技大学谭晓风教授鉴定为南山茶(CamelliasemiserrataChi.)。

1.1.2 试剂

柱层析硅胶：200～300目，青岛海洋化工厂分厂；

凝胶：Sephadex LH-20，美国GE Healthcare Bio-Science AB公司；

氘代试剂CH3OD：氘代率≥99.8%，美国Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 试验仪器

超导傅立叶变换核磁共振仪：Bruker avance III 600MHz型，瑞士Bruker公司；

高效液相色谱仪(分析型)：Waters 2695-2996型，配备Waters 2996 Photodiode Array Detector检测器，沃特世科技有限公司；

质谱仪：HPLC-QTOF/1290-6530型，安捷伦科技有限公司；

高效液相色谱仪(分析型)：LC3000型，配备Newstyle NU3000 Serials UV/VIS Detector检测器，北京创新恒通科技有限公司；

高效液相色谱仪(半制备)：LC3000型，北京创新恒通科技有限公司；

分析用色谱柱：C18ME(4.6 mm×250 mm，5 μm)、C18HCE (4.6 mm×250 mm，5 μm)、Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，华谱新创科技有限公司；

制备用色谱柱：C18HCE(20 mm×250 mm，10 μm)、C18ME(20 mm×250 mm，10 μm)，华谱新创科技有限公司。

1.2 样品制备

课题组[26]分离制备得到了一个高纯度的化合物16 mg，液相色谱检测其纯度约为99.1%，满足核磁结构鉴定的要求。

1.3 结构鉴定

1.3.1 质谱和液相色谱软件 Agilent UHPLC-QTOF/1290-6530 LC/MS配ESI电喷雾离子源数据采集和分析使用软件Mass Hunter Workstation software (Agilent Mass Hunter Workstation Software, Qualitative Analysis Version B.06.00, Build 6.0.633.0, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)。

1.3.2 LC-MS工作条件 Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，洗脱剂乙腈—水(体积比25∶75)，进样量2 μL，检测波长254 nm；电喷雾离子源正离子检测，氮气为干燥气，干燥气温度300 ℃，干燥气流速6 L/min，雾化器压力344 737.86 Pa，鞘气温度400 ℃，鞘气流速12 L/min，毛细管电压4 000 V，喷嘴电压0 V，参比离子流速10 μL/min，参比离子121.085 5，922.092 2，采集范围100～1 000，扫描速度2 scan/s。

1.3.3 核磁共振检测条件 溶剂为CH3OD，NMR的工作频率分别为1H谱600 MHz，13C谱为150 MHz，核磁共振一维和二维脉冲序列采用仪器的相应标准程序，1H-NMR谱采样脉冲宽度90°，累加32次；13C-NMR谱采样脉冲宽度90°，累加2 000次，H-H COSY、HSQC、HMBC这3种试验采样数据点阵均为F2×F1=2 048×256，零填充至2 048×1 024进行FT变换，窗函数处理谱图。

2 化合物的结构鉴定

课题组前期报道[26]，该化合物为黄色晶体，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，难溶于氯仿和水，盐酸镁粉反应显阳性，三氧化铝反应呈黄绿色荧光，Molish反应呈阳性，提示结构为黄酮苷类化合物。质谱准分子离子峰为m/z825.245 3[M+H]+，由安捷伦分子式计算器推测其分子式为C37H44O21，有离子碎片m/z679.1873 [(M+H)-146]+，287.055 0 [(M+H)-146-42-42-162]+，推测其化合物有山奈酚母核、1个葡萄糖基、2个鼠李糖基以及2个乙酰基。

1H-NMR(见图 1)中，δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)与δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)，其化学位移、裂分及耦合常数均符合苯环上间位氢的特征，推断其分属于山奈酚A环H-6与H-8。δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)与δ 6.89(2H, d,J=8.7 Hz)，通过积分面积可得该两组信号均包含2个质子，应属于对称结构，其化学位移、裂分及耦合常数符合苯环上邻位氢的特征，该结果与山奈酚B环结构相符合，因此推断其分属于山奈酚B环H-2'，6'与H-3'，5'。δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)为葡萄糖苷端基质子信号；δ 4.57(H, s)、5.05(H, s)为鼠李糖苷端基质子信号；δ 2.08(H, s)、2.00(H, s)为乙酰基质子信号；δ 1.22(H, d,J=6.2 Hz)、0.82(H, d,J=6.2 Hz)为鼠李糖苷甲基质子信号；δ 3.0～4.0段多组信号为糖苷其它质子信号，该结果与质谱推断相吻合。

13C-NMR(见图 2)中，δ 103.54、75.80、76.89、70.95、78.09、67.78为一组葡萄糖苷信号，δ 100.12、73.20、76.05、73.91、70.65、17.38以及δ 103.90、72.38、72.07、73.61、70.65、17.93为两组组鼠李糖苷信号，δ 171.79、20.79和δ 171.88、20.85则归属于乙酰基鼠李糖苷中的乙酰基，其余信号与山奈酚特征信号高度吻合，该结果与上述推断一致。

图1 1H-NMR图谱Figure 1 1H-NMR spectrum

图2 13C-NMR图谱Figure 2 13C-NMR spectrum

H-H COSY(见图 3)中，δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)与δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)，其特征符合苯环上间位氢的特征，推断其分属于山奈酚A环H-6与H-8；δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)与δ 6.89(2H, d,J=8.7 Hz)相互耦合，形成典型的对位取代苯的AA'BB'自旋耦合体系，符合山奈酚B环结构；δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)与δ 3.50(m)相互耦合，根据化学位移值可推断其δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)归属于葡萄糖苷端基，通过其耦合常数(J=7.3 Hz>7.0 Hz)可以判断，该葡萄糖苷键为β构型。δ 1.22(H, d,J=6.2 Hz)、0.82(H, d,J=6.2 Hz)均与δ 3.00～4.00(m)相互耦合，符合鼠李糖苷甲基质子信号特征。

HSQC(图 4)中，δ 98.83与δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)对应，δ 94.90与δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)对应，δ 132.25与δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)对应，δ 116.22与δ 6.89 (2H, d,J=8.7 Hz)对应，δ 103.54与δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)对应，δ 100.12与δ 4.57(H, s)对应，δ 103.90与δ 5.05(H, s)对应，δ 17.38与δ 1.22(H, d,J=6.2 Hz)对应，δ 17.93与结合TOCSY(见图 6)及HSQC，通过HMBC可确定不同片段的连接位点，δ 5.39(H, d,J=7.5 Hz)与δ 135.05相关，可知葡萄糖苷与山奈酚C-3相连；δ 4.57(H, s)与δ 67.78相关，可知该鼠李糖苷与Glu-C-6相连；δ 5.05(H, s)与δ 76.05相关，可知另一鼠李糖苷与之前的鼠李糖苷Rha(1)-C-3相连。δ 2.08(H, s)、2.00(H, s)分别与δ 73.20、73.91相关，可知2个乙酰基与鼠李糖苷Rha(1)-C-2及Rha(1)-C-4相连。综合所有核磁谱图及质谱结果，化合物鉴定为山奈酚-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1-3)-2,4-di-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1-6)]-β-D-葡萄糖苷，将其1H-NMR、13C-NMR以及质谱数据与文献[27]报道的化合物2对照，基本一致，其核磁信号归属见表 1，其结构式见图 7。Teng Xi-fang等[27]曾在红花油茶花中发现该化合物，在油茶籽中尚属首次发现。

图3 1H-1H COSY图谱Figure 3 1H-1H COSY spectrum

图4 HSQC图谱Figure 4 HSQC spectrum

δ 0.82(H, d,J=6.2 Hz)对应。

HMBC(见图 5)中，δ 6.11(H, d,J=1.7 Hz)与δ 163.13、166.46相关，δ 6.26(H, d,J=1.7 Hz)与δ 166.46、158.58相关，δ 8.03(2H, d,J=8.7 Hz)与δ 122.82、116.22、161.49相关，δ 6.89(2H, d,J=8.7 Hz)与δ 132.25、161.49、122.82相关，其特征与山奈酚完全符合。

图5 HMBC图谱Figure 5 HMBC spectrum

表1 1H-NMR及13C-NMR核磁信号归属 (溶剂为氘代甲醇)Table 1 Affiliation of 1H-NMR and 13C-NMR ( CD3OD for the solvent)

图6 TOCSY图谱Figure 6 TOCSY spectrum

图7 化合物的结构式及HMBC氢-碳相关Figure 7 Compound structure and HMBC H-C relation

3 结论

对于南山茶饼黄酮类化合物的深入研究，可以为油茶副产物的利用打下理论基础。试验中，南山茶饼提取物在乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析分离、纯化的基础上，用液相色谱半制备得到了纯度为99.1%的化合物16 mg。通过高清晰质谱和NMR，鉴定为：山奈酚-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1-3)-2,4-di-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1-6)]-β-D-葡萄糖苷，在油茶籽中属首次报道，对于该化合物的活性及其量效关系的研究将在以后的文中进行报道。

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Structure determination on a new acetyl flavonoid glycoside in seeds ofCamelliasemiserrataChi. by NMR spectroscopy

CAOQing-ming1,2

LANFang1

WANGWei-jie1

BAOLi-yuan1

ZHONGHai-yan1,2

(1.FacultyofFoodScienceandEngineering,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandProtectionforNon-WoodForestTrees〔CentralSouthUniversityofForestryandTechnology〕,MinistryofEducation,Changsha,Hunan410004,China)

A high-purity compound was extracted by solvent extraction, liquid-liquid separation, silica gel chromatography and high-performance liquid semi-preparative chromatography by using seeds ofCamelliasemiserrataChi. as raw materials. The compound was identified as kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1-3)- 2,4-di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)]-β-D-glucopyranoside, an acetyl flavonoid glycoside, by physical and chemical properties, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. Two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D-NMR) techniques including H-H COSY, HSQC, HMBC and TOCSY were used to affiliate its1H and13C NMR chemical shift and explain the structure.

2D-NMR;CamelliasemiserrataChi.; Acetyl flavonoid glycoside; Structure analysis

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划(编号：XJT2016〔283〕-254)；湖南省教育厅重点项目(编号：17A2292017)；湖南省林业厅项目(编号：XLK201664，XKL201735)；湖南省科技重大专项(编号：2016NK1001)

曹清明，女，中南林业科技大学副教授，博士。

钟海雁(1963—)，男，中南林业科技大学教授，博士。 E-mail:zhonghaiyan631210@126.com

2017—04—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.004