肠道上皮细胞再生修复与恶性转化的研究现状

姜 蒙 综述 刘 明 审校

肠道上皮细胞再生修复与恶性转化的研究现状

姜 蒙 综述 刘 明 审校

肠黏膜慢性炎症是肠道肿瘤发展的重要组成部分。近期，对肠道肿瘤患者的高通量测序研究发现了一个潜在的、以伤口愈合和先天免疫基因过表达为特征的结肠癌分子亚型，它提示了一种可能依赖于炎症细胞和细胞因子的肿瘤发展机制，增强了我们对细胞恶性转化的理解，以及突出了抗炎在肿瘤治疗中的作用。本文将对正常的肠黏膜更新、伤口愈合和恶变的机制做一综述。

肠上皮；炎症损伤；恶性转化

肠上皮是更新速度最快的组织之一，成人肠道上皮细胞缺损数量可达到1011个/天，约为200 g[1]。通常情况下缺损的上皮细胞会由位于肠隐窝的一小群干细胞进行再生性修复[2]，但在慢性损伤及炎症中，激活的固有免疫系统会引起组织重构，组成慢性炎症相关的微环境，使肠道上皮不能正常再生，从而增加了肠上皮细胞恶性转化的风险[3]。在最近的关于结肠癌分子分型的研究中发现，现有的结肠癌大都可以归结为四种不同的类型[4]：(1)以免疫系统激活，T细胞浸润为特征的类型；(2)以Wnt信号过度激活为特征，符合肿瘤发生经典理论的类型；(3)以代谢失调，K-Ras突变为特征的类型；(4)以固有免疫应答，如补体信号通路及伤口愈合相关的基因表达升高，基质细胞增生及组织重构为特征的类型，该类型结肠癌的患者往往预后最差[5]。这提示了至少一种类型的肠道肿瘤发生与肠道损伤修复及再生密切相关，组织损伤及重构所提供的炎症微环境可能是肿瘤发生的危险因素。本文对近年来关于肠道上皮损伤、修复及恶性转化的研究进行系统性阐述。

1 肠上皮细胞的再生机制

肠上皮细胞再生是肠黏膜固有层损伤的恢复过程，涉及肠上皮细胞的增生、移行和细胞功能的变化。从目前已有的研究结果来看，肠上皮的再生至少由3个不同的但可互相调控的系统共同控制，它们分别是：(1)负责维持干细胞自我更新及形成干细胞储备池的Wnt信号途径；(2)负责调控细胞周期，为细胞增殖与DNA损伤修复限定时间窗的昼夜节律系统(Circadian clock system)；(3)负责黏膜损伤后修复，对抗病原体入侵及维持微环境稳定的模式识别受体(Toll like receptor，TLR)信号通路。

1.1 Wnt/Notch信号及肠黏膜干细胞自我更新

成年人的小肠上皮组织中，小肠上皮细胞(Small intestine epithelium cell，SIEC)会参与形成肠绒毛，而每个肠绒毛至少由6个肠隐窝包围，每个肠隐窝中都存在维持肠绒毛更新的干细胞群及由干细胞分化而成的潘氏细胞、吸收细胞、内分泌细胞、刷状细胞及杯状细胞。然而在结肠中，为了挤压粪便并加速排泄，上皮细胞会排列成平整表面而不会形成绒毛结构[6]，与小肠相比结肠有更多的杯状细胞，但几乎没有潘氏细胞。肠上皮的再生有明显的层次结构，隐窝底部为Lgr5+干细胞群，周围包裹着由其分化而来的潘氏细胞及+4干细胞(即静态储备干细胞)，储备干细胞持续分化，成为中间层的增殖区细胞，进入细胞周期并表达Ki-67，顶层细胞进入终末分化，成为SIEC。在分子水平，肠上皮干细胞微环境主要由Wnt信号通路维持，隐窝中CD24+的潘氏细胞分泌Wnt3A、EGF、TGF-α及Notch信号配体Dll4[7]，其中Wnt3A负责激活经典Wnt信号通路，同时上调Wnt靶向基因Lgr5，升高的Lgr5联合R-spondin信号，阻止ZNRF3对Wnt3A受体Frizzled的泛素化作用，保证Frizzled在细胞膜表面大量聚集，持续结合Wnt3A保证细胞维持干细胞特征[8]。而在细胞内部，由于Wnt3A的作用，APC/GSK-3β/CKI复合物对Wnt核心转录因子β-catenin的磷酸化被抑制，非磷酸化形式的β-catenin无法被降解，进而激活下游干细胞相关基因，包括Lgr5的转录[9]。如果该区域的Wnt信号被抑制，则会出现不可耐受的肠上皮缺损[10]。随着子代细胞逐步离开隐窝区，Wnt信号持续减弱，SIEC进入终末分化，而未离开隐窝区的干细胞则持续表达Lgr5，分化为静息干细胞，形成干细胞储备池，在急性损伤后参与伤口修复[11]。Lgr5缺失的小鼠，在放射性损伤后，其上皮细胞不能再生，但Lgr5的缺失对葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate，DSS)损伤造成的炎性增生则抑制效果甚微[12]，这可能是由于DSS损伤提供的炎症微环境中FGF和PDGF的代偿作用。Notch信号负责SIEC的分化方向，肠隐窝区通常有两种Notch受体，Notch receptor 1/2，Notch1受体缺失会导致杯状细胞增生，Lgr5+细胞减少，而Notch2缺失后则不会出现相关表型。Notch1/2同时缺失的小鼠同样不能耐受放射性损伤[13]。可见，肠上皮再生的细胞基础是由Wnt与Notch信号通路共同维持，是肠道上皮再生的细胞基础(图1)。

图1 肠道上皮细胞的自我更新和调控Figure 1 Self renewal and regulation of intestinal epithelial cells

1.2 Circadian Clock节律性作用

几乎所有的人体器官都受到昼夜节律即生物钟的影响，该系统使生物体在对抗外界环境的变化中保持稳定，包括进食、睡眠、代谢和DNA修复等。生物钟的本质是一个基于节律性基因PER1/2、CLOCK、BAML1和CRY1/2的负反馈环，BAML1/CLOCK会结合到PER/CRY的转录区，增强PER/CRY转录，而在胞浆中的PER在被CK1ε磷酸化后会进入细胞核联合CRY，并与BAML1/CLOCK结合形成巨大的转录复合物来抑制自身的表达，同时抑制由BLMAL1/CLOCK控制的其它节律表达基因的转录，故节律表达基因如PER随时间变化的表达曲线类似于正弦曲线，波峰之间的间隔大约是24 h[14]。SIEC的更新同样显示出明显的节律倾向。在小鼠模型中节律性的进食行为会促进SIEC增殖并保持肠屏蔽完整[15]。相反CLOCK基因突变失活后，失去节律的小鼠肠黏膜屏蔽不完整，被沙门菌感染时，细菌更容易通过肠屏蔽，引发的症状也更为严重[16]。在体外培养的肠道干细胞经血清休克后，节律基因Per2表达即可显示出周期性变化[17]。进一步的研究显示，Phillip等[18]在果蝇模型中证明了在小肠自我更新的过程中数百个转录事件受到Per调控，打断节律后小肠干细胞会出现异常分化。之后的研究还发现，节律基因调控的细胞周期的准入机制可能是Per共刺激因子NONO调节细胞周期抑制蛋白p16转录导致的，NONO缺失的小鼠伤口愈合模型中，伤口处的细胞虽然可以增殖，但伤口不能愈合，这意味着正常节律对于完成创伤修复是必须的[19]，但这一调控机制是否在肠道上皮细胞中同样存在，还需要进一步的证据。值得注意的是，参与磷酸化Per的CK1ε同样可以调节Wnt/β-catenin的激活[20]，但是目前还不清楚肠道上皮Lgr5+细胞是否也受节律信号控制。

1.3 TLR家族与损伤后修复

同所有其它组织器官类似，肠道损伤后再生也涉及到凝血、炎症、增殖和组织重塑的过程，这与生理情况下的再生有明显的不同。损伤发生后通过凝血级联反应防止进行性血液流失，并激活补体在内的免疫系统，去除坏死组织预防感染，同时趋化中性粒细胞吞噬细菌，并降解细菌产物。2～3天后，单核细胞出现在伤口，并分化为巨噬细胞分泌TGF-β、PDGF和EGF等，刺激纤维母细胞分化为成纤维细胞或肌成纤维细胞，三者共同构成肉芽组织，2～3周后，大部分内皮细胞、巨噬细胞及纤维细胞凋亡。肠道损伤与肠上皮细胞再生中，几乎一切分子调控机制均需依赖于TLR的启动，这是一组位于免疫细胞及上皮细胞膜表面或细胞浆中的受体家族，用来检测PAMP(Pathogen associated molecular pattern)和DAMP(Damage associated molecular pattern)维持肠道稳态，并制定细胞损伤和死亡的阈值[21]。TLR1，2，4，5，6在细胞膜表面，而TLR3，7，8，9位于细胞内的内体(Endomsome)。其识别的PAMPS包括肽聚糖，脂肽和脂蛋白，LPS，单链或双链的RNA/DNA，几乎所有的TLR最终都会激活NF-κB，促进炎性因子的释放[22]，如TLR3可识别病毒，或组织破损释放出的双链RNA，激活NF-κB信号促进IFN-β及其它细胞因子表达，以TLR3激动剂治疗伤口，可促进伤口愈合[23]，这可能是由于TLR的过度激活使更多的中性粒细胞或巨噬细胞趋化到伤口处，并分泌更多的生长因子导致的。如果TLR受体家族持续激活，则炎症不能消退，最终会使纤维细胞过度增生，导致组织纤维化[24]。在没有病原体入侵的情况下，肠道中TLR家族基因表达同样显示出昼夜节律，节律性基因通过调整包括TLR的周期性表达来调节括肠道代谢和肠道微生物的动态平衡。在TLR9依赖的脓毒血症模型中，疾病的严重程度和刺激的时间点相关，和TLR9的节律性表达一致[25]，而Cry1-/-，Cry2-/-的小鼠成纤维细胞会持续分泌IL-6、TNF-α[26]。这说明节律基因的激活和炎症的发生不能同时存在。在CLOCK/BAML1，Per/CRY组成的负反馈环路中，SFPQ会联合CLOCK/BMAL1与PER/CRY结合到的Per1转录起始区，并富集Sin3A抑制Per1自身的表达，形成负反馈环路[27]，但同时SFPQ也是炎症微环境中重要的趋化因子IL-8的转录抑制因子，而当TLR激活时，SFPQ会离开原始位置并进入Paraspeckles，并激活下游基因包括IL-8的转录[28]，这时CLOCK/BAML1也会由于失去SFPQ而无法与Per/CRY形成负反馈环路。故在正常的生理情况下，肠上皮再生受Wnt信号及昼夜节律的共同调控，而病原体入侵，炎症发生时，肠上皮的修复则由TLR信号控制，直到病原微生物被清除，TLR信号重新沉默(图2)。这也能部分解释为何昼夜节律时常会增加溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的风险[29]。

图2 肠道上皮损伤后再生Figure 2 Epithelium intestinal regeneration after injury

2 损伤后异常修复及细胞的恶性转化

在生理情况下，肠上皮细胞的再生由隐窝区的干细胞分化支持，细胞的增殖受到节律性基因时间窗的严格限制，但在损伤后修复的情况下，由于TLR的激活，细胞节律被打断，这时细胞的增殖主要由微环境中生长因子来控制，直到炎症刺激因子消失，节律重塑后伤口才会趋于愈合。整个过程依赖于3个核心信号通路的精确调控，Wnt信号提供增殖所需的干细胞，TLR负责对抗损伤和调节组织再生，节律信号通路负责统筹再生与炎症。这其中任何环节错误均可影响到其他信号，形成不愈合的创伤。根据肠上皮再生的原理，人们已经成功的在含有Wnt3A、R-spondin、EGF和Notch配体的条件性培养基中长时间培养Lgr5+细胞，并用其作为细胞来源对抗DSS引起的急性损伤[30]，但对于慢性损伤后癌变的过程我们仍然知之甚少。在过去对于炎症微环境持续存在引起的肿瘤发生的机制中，人们更为关注的是炎性微环境本身，这包括先天性免疫应答的细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、血小板及细胞因子(IL-6，IL-8，TGF-β等)而上皮细胞本身对于外界炎性微环境中的压力应答则知之甚少。根据已有的文献报道，在细胞处于压力应激的条件下，细胞核内的蛋白质和一种长链非编码RNA(Long-noncoding RNA，Lnc RNA)NEAT1可组成名为Paraspeckes的蛋白复合物。这其中就包含了前文中提到的节律相关蛋白SFPQ及NONO[31]，而NEAT1则是Paraspeckles形成的必要条件，其转录激活是由p53失活或TLR受体家族受刺激引起的[32]，而这两个生物事件恰恰是溃疡相关结肠肿瘤发生的首发事件[33]。肠道损伤异常愈合或不愈合常出现在溃疡性结肠炎或克罗恩氏病，而炎症性肠疾病的患者有很高的几率发展成溃疡相关的结肠癌[34]，尽管已经有诸多的证据阐明了慢性炎症及结肠癌的共同特征，但我们仍没有充足的数据来描述整个过程。不过，上述的三种信号通路，特别是节律基因表达下降及TLR的过度激活，在肿瘤中十分常见。节律性基因控制着细胞周期监测点和DNA修复，而免疫刺激和炎症激活反而可以打断节律调控，结合炎症微环境中生长因子的长期刺激，会极大的提高体细胞突变的风险，最终导致肿瘤。

3 小结与展望

肠道肿瘤的发生和慢性炎症息息相关，到目前为止，人们尚未找到肠道慢性炎症的真正原因，因此对于炎症相关的结肠癌的预防就变得十分困难。如上文所述，至少由两套系统控制着肠道上皮的再生和修复，分别是昼夜节律系统和TLR相关的炎症系统，二者通常不能同时存在。这意味着在慢性损伤中，TLR调控的炎症微环境将代替昼夜节律系统对肠道再生与修复的控制，同时由于TLR系统中持续存在的生长因子及细胞因子会提高细胞恶变的风险，故如何应用昼夜节律系统代替炎症系统可能是今后研究的方向。

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(收稿：2016-04-19)

Self renewal，repair and malignant transformation of intestine epithelial cells

JIANGMeng，LIUMing

The Fourth Affiliated of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

Chronic inflammation of intestine mucosal has been considered as a critical component of colorectal cancer development.Recently，the studies based on high throughput sequencing of colorectal cancer patients released a potential molecular subtype of colorectal cancer，characterized by wound healing and innate immune genes.It suggests that a probably mechanism described by a subset of cells that may be dependent on inflammatory cells and cytokines of tumor development，extremely expanding our insight of cell malignant transformation，and highlight the anti-inflammation treatment.This article will review the normal mechanism of intestine mucosal renewal，wound healing and malignant transformation.

Intestine mucosal；Chronicinflammation；Malignant transformation

哈尔滨医科大学附属第四医院普外科(哈尔滨 150001)

姜蒙，男，(1988-)，硕士研究生，从事肠道肿瘤的研究。

刘明，E-mail：mLiu35@aliyun.com

R320.2710

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.015