DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性研究

赵利锋 程伟华 雷 达 杨彦伟 王 钢

DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性研究

赵利锋 程伟华 雷 达 杨彦伟 王 钢

目的 探讨DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性。方法 选择2005年1月—2012年12月来我院行切除治疗肝内胆管癌患者78例，制作肝内胆管细胞癌组织及癌旁组织的组织芯片，并于术前进行生化指标测定。患者术后每隔3个月复查1次，并结合患者的临床资料和病历资料，采用Kaplan-Meier法进行无复发生存曲线及总生存曲线的绘制，采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，确定影响预后无复发生存时间(Relapse-free survival，RFS)和总生存时间(Overall survival，OS)的因素。结果 DKK1蛋白表达阴性与表达阳性的患者间GGT、肝门淋巴结侵犯、Child-Pugh分级、MMP9差异存在统计学意义(P<0.05)。78例肝内胆管细胞癌患者组织芯片结果发现DKK1蛋白在肝内胆管细胞癌的阳性表达率为35.90%(28/78)，在癌旁组织中的阳性表达率为14.10%(11/78)。78例肝内胆管细胞癌患者的1、3、5年的总生存率和无复发生存率分别为51.28%(40/78)与50.00%(38/78)、41.03%(32/78)与38.46%(30/78)、25.64%(20/78)与23.08%(18/78)。相关危险性因素经单因素、多因素分析后，研究结果显示GGT、CA19-9、CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者RFS的预后因素；CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者DFS的预后因素。DKK1蛋白表达阳性与阴性的OS与RFS曲线显示，5年后肝内胆管细胞癌患者DKK1蛋白表达阳性与阴性的总生存率分别为28.20%与20.51%；无复发生存率分别为24.36%与21.79%。结论 肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯与否与DKK1蛋白表达密切相关，DKK1蛋白表达可能是影响肝内胆管细胞癌患者OS和RFS的预后因素。

DKK1蛋白；肝内胆管细胞癌；淋巴结侵犯；预后

肝内胆管细胞癌是一种肝内胆管细胞恶性增生性疾病，在全球范围内是第二常见的原发恶性肿瘤[1]。有报道指出，肿瘤分化、手术方式和手术部位等是其发生的危险因素[2]。但是不同地区，其危险因素有很大变异，如在东亚地区，此病的发病与吸虫感染密切相关，而在西方国家，原发性胆管硬化性炎症是肝内胆管细胞癌的危险性因素[3]。近年来，行手术切除治疗肝内胆管细胞癌患者自然生存期仅为6～12个月，主要原因是手术切除率低，且术后高转移复发率影响患者长期生存[4]。所以，寻找肝内胆管细胞癌发生以及转移复发中的关键因素，对于改善患者预后有重要意义。DKK1作为一种分泌性蛋白，在胚胎早期发育过程中最先表达[5]。大量文献报道证实，DKK1在肿瘤的发生、发展中起重要作用[6]。Ruo等的研究表明DKK1在肝癌的侵袭与复发中发挥重要作用，并可作为预后指标的重要预测因素[7]。本研究为探讨DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性，对78例肝内胆管细胞癌患者的标本进行组织芯片检测。

1 资料与方法

1.1 临床病理资料

选择2005年1月—2012年12月来我院行切除治疗肝内胆管癌患者78例。其中，男45例，女33例。年龄34～79岁，平均(58.21±16.96)岁，中位年龄59岁。本研究获得我院医学伦理学委员会批准，且所有研究对象均知情同意。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：按照世界卫生组织《肝内胆管癌诊断标准》术前均未接受放疗或化疗，且术后经病理切片染色证实肝内胆管细胞癌[8]；切除标准符合外科肿瘤完整切除、边缘未发现癌组织、局部受侵犯淋巴结清扫的标准，手术边缘>1 cm；肝内胆管细胞癌患者的标本蜡块包埋完整；随访资料完整准确；肿瘤的分化参照Edmondson分级标准[9]；肿瘤的分期参照国际抗癌联合会第七版标准[10]。排除标准：混合型肝癌；合并其他恶性肿瘤；未获得随访。

1.3 试验耗材及仪器

兔抗人DKK1多克隆抗体购自Santa Cruz公司；SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂购自上海通蔚科技有限公司；3%过氧化氢、二甲苯、无水乙醇、1%盐酸乙醇购自北京九州天瑞科技有限公司；水溶性封片剂、苏木素液购自上海威奥生物科技有限公司；图像分析仪购自Alpha Innotech公司；光学显微镜、倒置显微镜购自Olympus公司；-70℃冰箱购自无锡倍斯特仪器有限公司。

1.4 组织芯片制作及判定标准

参照余杏娟等人的组织芯片设计与制作程序[11]。主要分为受体蜡块的制作、供体蜡块的取样及点样、组织芯片制备、切片。DKK1判定标准参照文献[7]。

1.5 生化指标测定

抽取患者术前的清晨空腹静脉血2～10 mL，应用深圳雷杜公司RT7200全自动血液分析仪检测血常规。应用日本奥林巴斯公司AU2700型全自动生化分析仪测定乙肝表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)、γ谷氨酰基转移酶(GGT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血清糖类抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)、基质金属蛋白酶9(MMP9)等指标。

1.6 随访

患者术后每隔3个月复查1次胸部X线、超声、肿瘤标志物(CA19-9、AFP、CEA)，若结果异常则增强CT或MRI复查。根据CT和MRI结果诊断是否复发，必要时行穿刺或手术确诊。临床医师结合本院门诊复查病例资料及电话进行随访，随访至患者死亡或2015年12月31日。其中，手术至复发的时间间隔为RFS，手术至死亡或末次随访日期为OS。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 患者临床特征

78例ICC患者中DKK1蛋白表达阴性47例，表达阳性31例，DKK1蛋白表达阴性与表达阳性的患者间性别、年龄、HBsAg、HCV、ALT、CA19-9、CEA、AFP、肿瘤大小、肿瘤分化、肿瘤数量、TNM分型、VEGF-C差异无统计学意义(P>0.05)；GGT、肝门淋巴结侵犯、Child-Pugh分级、MMP9差异存在统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2 DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌临床病理特征的关系

78例肝内胆管细胞癌患者组织芯片结果显示，DKK1蛋白呈棕黄色或棕褐色，染色比较均一，且DKK1蛋白定位于肝内胆管癌细胞胞浆(图1，图2)。DKK1蛋白在肝内胆管细胞癌的阳性表达率为35.90%(28/78)，在癌旁组织中的阳性表达率为14.10%(11/78)。

图1 免疫组化检测DKK1蛋白表达Figure 1 Immunohistochemical detection of DKK1 protein expressionNote：a.HE immunohistochemical staining(100×)；b，c，d and e.DKK1 protein expression from low to high in cholangiocarcinoma tissues(100×)；f.The low expression of DKK1 protein in the adjacent tissues of intrahepatic cholangiocarcinoma(100×).

图2 DKK1蛋白表达预测肝内胆管癌患者OS及RFS作用Figure 2 Expression of DKK1 protein in the prediction of OS and RFS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma

CharacteristicsDKKIproteinNegativePositivePGender0.96Male2718Female2013Age(year)0.52<4514845～601916>60147HBsAg0.61Positive3018Negative1713GGT(U/L)0.03≤542710>542021HCV1.00Positive00Negative4731ALT(U/L)0.88≤754026>7575CA19-9(U/mL)0.28≤372015>372716CEA(ng/mL)0.61≤53721>51010AFP(ng/mL)0.37≤203218>201513Tumorsize(cm)0.97≤51812>52919Tumordifferentiation0.13Ⅰ～Ⅱ3518Ⅲ～Ⅳ1213Tumorsize0.35Single3520Multiple1211Hepatichilarlymphnodeinvasion<0.01Yes715No4016Child-Pughclassification<0.01A4115B616TNMtype0.35Ⅰ～Ⅱ3520Ⅲ～Ⅳ1211VEGF-C0.28Positive3016Negative1715MMP90.02Positive3213Negative1518

2.3 DKK1的表达与肝内胆管细胞癌患者预后的关系

78例肝内胆管细胞癌患者的1、3、5年的总生存率和无复发生存率分别为51.28%(40/78)与50.00%(38/78)、41.03%(32/78)与38.46%(30/78)、25.64%(20/78)与23.08%(18/78)。将表1中的相关因素经单因素、多因素分析后，研究结果显示GGT、CA19-9、CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者OS的预后因素；CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者RFS的预后因素(表2)。DKK1蛋白表达阳性与阴性的OS与RFS的生存曲线显示，5年后肝内胆管细胞癌患者DKK1蛋白表达阳性与阴性的总生存率分别为29.03%(9/31)与21.28%(10/47)，差异存在统计学意义(P<0.05)；无复发生存率分别为25.81%(8/31)与21.28%(10/47)，差异存在统计学意义(P<0.05)(图2)。

表2 影响肝内胆管细胞癌患者预后的多因素分析

3 讨论

目前，限制肝癌治疗临床疗效的最主要瓶颈是肝癌术后转移复发，而往往肝内胆管细胞癌其根治性切除术后3、5年内的复发转移者比单纯肝细胞肝癌更差。肝内胆管细胞癌患者接受手术治疗后转移、复发很大程度上是由于瘤细胞从原发灶播散到肝内其他部位和远处的组织及器官，是患者预后不佳的最主要原因[12]。因此，探索肿瘤转移和复发的调控机制，寻找有效的治疗方法是进一步提高癌症患者生存的关键。本研究中，DKK1蛋白表达阴性与表达阳性的患者间性别、年龄、HBsAg、HCV、ALT、CA19-9、CEA、AFP、肿瘤大小、肿瘤分化、肿瘤数量、TNM分型、VEGF-C差异无统计学意义(P>0.05)；GGT、肝门淋巴结侵犯、Child-Pugh分级、MMP9差异存在统计学意义(P<0.05)。研究结果表明，DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯相关，发生淋巴结侵犯的患者DKK1蛋白阳性表达率高。

组织芯片，也称组织微阵列，是生物芯片技术的一个重要分支，是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上，进行同一指标的原位组织学研究[13]。该技术自1998年由Kononen等提出以来，以其大规模、高通量、标准化等优点得到大范围的推广应用[14]。与传统方法相比较，组织芯片可保证在同一张玻片上进行免疫组化染色，在一定程度上保证其较小的实验误差，并可一次性获取大量研究信息，使效率成百上千提高的同时缩减研究经费。组织芯片技术可以与其他很多常规技术如免疫组织化学、核酸原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR等结合应用，目前己大量应用于肿瘤、干细胞研究中。本研究结果显示，78例肝内胆管细胞癌患者组织芯片的DKK1蛋白呈棕黄色或棕褐色，染色比较均一，且DKK1蛋白定位于肝内胆管癌细胞胞浆。DKK1蛋白在肝内胆管细胞癌的阳性表达率为35.90%(28/78)，在癌旁组织中的阳性表达率为14.10%(11/78)，表明DKK1蛋白高表达于肝内胆管细胞癌组织中。

大量文献报道有关于DKK1基因在肿瘤患者中的预后预测价值。Yamabuki等研究结果显示DKK1蛋白在肺癌和食管癌中的表达是影响预后的危险性因素[15]。Forget等研究结果显示DKK1蛋白的高表达预示着激素抵抗的乳腺癌患者预后不良[16]。Yamabuki等则在食管鳞癌患者中发现DKK1蛋白是影响患者预后的独立因素[15]。我国于彬等的研究则证实了DKK1蛋白的高表达预示着肝细胞肝癌患者预后不良[17]。目前，有关DKK1蛋白对肝内胆管细胞癌中的预后价值的报道较少。本研究结果显示，78例肝内胆管细胞癌患者的1、3、5年的总生存率和无复发生存率分别为51.28%(40/78)与50.00%(38/78)、41.03%(32/78)与38.46%(30/78)、25.64%(20/78)与23.08%(18/78)。将相关因素经单因素、多因素分析后，研究结果显示GGT、CA19-9、CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者RFS的预后因素；CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者DFS的预后因素。DKK1蛋白表达阳性与阴性的OS与RFS曲线显示，5年后肝内胆管细胞癌患者DKK1蛋白表达阳性与阴性的总生存率分别为28.20%与20.51%；无复发生存率分别为24.36%与21.79%。研究结果表明，DKK1蛋白的表达是影响肝内胆管细胞癌患者OS和RFS的预后因素，但不是唯一预后因素。本研究为分子水平研究DKK1基因价值奠定临床研究基础。本研究结果还显示CEA、肿瘤大小、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者OS和RFS的预后因素。因此，后续实验研究中还应联合CEA与DKKl、肿瘤大小与DKKl、肝门淋巴结侵犯与DKKl的表达情况，是否对提高肝内胆管细胞癌患者预测效用的价值进行研究。

综上所述，DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯相关，发生淋巴结侵犯的患者DKK1蛋白阳性表达率高。DKK1蛋白的表达可能是影响肝内胆管细胞癌患者OS和RFS的预后因素，但不是唯一预后因素。

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(收稿：2016-10-24)

The relationship between DKK1 protein expression and lymph node invasion，and prognosis in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma

ZHAOLifeng，CHENGWeihua，LEIDa，YANGYanwei，WANGGang

Department of Hepatobiliary Surgery，Central Hospital of Baoji，Baoji 721008，China

Objective The objectives of this study were to investigate the relationship between DKK1 protein expression and lymph node invasion，and prognosis in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.Methods From January 2005 to December 2012，78 patients with intrahepatic cholangiocarcinoma were treated with endoscopic resection.Tissue microarray of intrahepatic cholangiocarcinoma and adjacent tissues were done and biochemical indexes were measured before operation.The patients were recruited every 3 months after operation.The Kaplan-Meier method was used to analyze the recurrence-free survival curve and the overall survival curve.The Cox proportional hazards regression model was used to analyze the multivariate analysis and to determine the factors that affect the disease-free survival(RFS)and overall survival(OS).Results There were significant differences in the expression of GGT，hepatic portal lymph node invasion，Child-Pugh grade，MMP9 and DKK1 protein in the negative and positive expression of intrahepatic cholangiocarcinoma(P<0.05).The positive expression rate of DKK1 protein in intrahepatic cholangiocarcinoma was 35.90%(28/78)，and the positive expression rate of DKK1 protein in hilar cholangiocarcinoma was 14.10%(11/78).RFS and OS in 78 cases of intrahepatic cholangiocarcinoma were 51.28%(40/78)and 50.00%(38/78)，41.03%(32/78)and 38.46%(30/78)，25.64%(20/78)and 23.08%(18/78)after surgery for 1，3 and 5 years，respectively.The results from univariate and multivariate analysis showed that GGT，CA19-9，CEA，tumor size，DKK1 and hilar lymph node invasion were the prognostic factors of OS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.CEA，tumor size，DKK1 and hilar lymph node involvement were prognostic factors for RFS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.DKK1 protein expression positive and negative OS curve or RFS curve showed that 5 years after intrahepatic cholangiocarcinoma patients DKK1 protein expression positive and negative OS were 28.20% and 20.51%；RFS were 24.36% and 21.79%.Conclusion The expression of DKK1 protein is closely related to lymph node invasion in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.The expression of DKK1 protein is the prognostic factor of OS and RFS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.

DKK1 protein；Intrahepatic cholangiocarcinoma；Lymph node invasion；Prognosis

宝鸡市中心医院肝胆外科(宝鸡 721008)

赵利锋，男，(1978-)，本科，主治医师，从事肝胆疾病外科治疗方面的研究。

王钢，E-mail：wangg1971@163.com

R735.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.007