STAT1基因敲除提高小鼠对EV71病毒的敏感性研究

李光超　张倩　武婧

[摘要] 目的 分析STAT1基因敲除小鼠免疫相关因子表达差异，观察STAT1基因敲除小鼠感染EV71病毒后的症状表现及病毒载量，为EV71抗病毒治疗提供数据基础。 方法 LPS刺激STAT1基因敲除小鼠后，利用微珠免疫分析（CBA）方法对血清免疫相关因子定量分析；EV71感染STAT1基因敲除小鼠后，观察症状及病理表现，利用实时荧光定量检测对肌肉病毒RNA定量分析。 结果 LPS刺激后，STAT1基因敲除小鼠血清多种细胞因子分泌水平下降（P < 0.01）；EV71感染后，STAT1基因敲除小鼠病理损伤加重，肌肉中病毒载量升高（P < 0.01），与野生型小鼠相比表现出更严重的症状与更高的死亡率。 结论 STAT1在抗EV71感染的免疫过程中扮演重要角色，提示STAT1基因敲除可以提高小鼠对EV71病毒的敏感性。

[关键词] 病毒感染；EV71；STAT1；炎症因子

[中图分类号] R373 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（c）-0014-05

[Abstract] Objective To analyze the differential expression of immune-associated factors in STAT1 knockout mice， and observe the symptoms and viral load after EV71 virus infection， in order to provide a data base for anti-EV71 therapy. Methods Cytometric bead assay （CBA） was used to quantitative analysis the levels of serum immune-associated factors in STAT1 knockout mice after LPS-induced treatment. The symptom and tissue pathological features were observed and the level of muscle virus RNA was quantitated by real-time PCR in STAT1 knockout mice after EV71 virus infection. Results The levels of multi- immune-associated factors were decreased in STAT1 knockout mice after LPS stimulating （P < 0.01）， and pathological damage was aggravated accompanied by the higher viral load in muscle （P < 0.01）， also severe symptoms and higher mortality when compared to wide type mice after EV71 infection. Conclusions STAT1 plays an important role in the immune responseafter EV71 infection.Thus， STAT1 gene deletion can improve the sensitivity of mice to EV71 virus.

[Key words] Virus infection； EV71； STAT1； Inflammatory cytokines

手足口病是嬰幼儿最常见的传染病，好发于5岁以下婴幼儿[1]。肠道病毒71型（EV71）属于人类肠道病毒A属的小RNA病毒科，为常见的引起手足口病的病毒之一。病毒在肠道存活时间可达10周[2]，引起严重的临床症状，甚至导致患者死亡[3]。婴幼儿感染EV71后，常发生手、足、口疱疹，以及引发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性迟缓性麻痹、神经源性水肿等多种神经性疾病[4]。据统计，手足口病患者中感染EV71所导致的患者死亡率始终居高不下[5]。

JAK/STAT信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路。STAT1作为STAT家族发现的第一个成员，是JAK/STAT信号通路中的关键转录因子，具有免疫调节、抑制细胞生长和促进细胞凋亡等功能[6]，在机体抗肿瘤免疫中也发挥重要的作用[7]。脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，作为细菌引起机体发热反应的主要成分之一，可引起免疫炎性反应[8]。研究发现当给予小鼠LPS刺激后，STAT1可与TLR4协同作用，使细胞因子分泌水平升高，发挥免疫调节的功能[9]。

STAT1也是机体免疫系统实现抗病毒、减少组织损伤的的媒介之一，调节JAK/STAT通路可以对EV71病毒的感染免疫产生影响[10]。STAT1在EV71病毒感染过程中可以发挥抗病毒的作用，同时EV71病毒也可以影响STAT1信号通路的激活。对EV71病毒感染细胞进程中STAT1的影响进行研究发现，THP-1细胞的在EV71感染后STAT1磷酸化水平增加，使JAK/STAT信号通路激活[11]；横纹肌肉瘤（RD）细胞STAT1介导的信号通路在EV71感染后，会通过干扰素途径使其激活[12]。目前对EV71感染进程中STAT1的作用研究多处于细胞水平[13]，利用STAT1基因敲除的小鼠模型进行动物整体水平的研究鲜有报道。本研究利用STAT1敲除的C57BL/6小鼠模型，在整体动物水平探讨STAT1基因对EV71病毒复制的影响，为减少病毒复制及控制感染症状等治疗提供可靠的数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂与仪器 Trizol试剂 （Life Technologies）；cDNA反转录试剂盒（Thermo Scientific）；实时荧光定量检测染料（Applied Biosystems）；鼠抗EV71单克隆抗体（Millipore， MAB979）；细胞CBA检测抗体（BD）。流式细胞仪（BD FACSCanto II）；激光共聚焦显微镜（Leica Microsystems GmbH）。

1.1.2 病毒 病毒为医学实验动物研究所EV71课题组利用EV71病毒FY0805病毒株，经ICR小鼠传代适应株MP10（Accession number： HQ712020）[14]，储存滴度1×109 TCID50。

1.1.3 实验动物 SPF级STAT1-/- C57BL/6小鼠22只，体重7～9 g，10日龄；SPF级STAT1+/- C57BL/6小鼠20只，体重7～9 g，10日龄；SPF级野生型C57BL/6小鼠20只，体重7～9 g，10日龄；实验动物由医学实验动物研究所实验动物资源研究中心研制，实验动物合格证号：SCXK（京）2014-0004，试验单位使用许可证编号：SYXK（京）2015-0035。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 LPS刺激组：STAT1-/- （n = 10）， STAT1+/- （n = 8），野生型 （n = 8）。EV71感染组：STAT1-/- （n = 6），STAT1+/-（n = 6），野生型 （n = 6）。卫星组：STAT 1-/- （n = 6），STAT1+/-（n = 6），野生型（n = 6）。

1.2.2 LPS刺激 3周龄C57BL/6小鼠腹腔注射LPS，剂量为每克体重10 μg。注射后24 h取小鼠血清，CBA方法检测血清IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12/IL-23p40、MIP-1α、TNF-α。

1.2.3 EV71病毒感染及一般指标检测 EV71感染组及卫星组C57BL/6小鼠10日龄，腹腔注射1×107 TCID50（致死剂量），在感染后9 d内每日观察并记录体重、症状、生存率指标。临床症状评分为：0，无症状；1，竖毛；2，后肢行动迟缓；3，单侧后肢瘫痪；4，全部后肢瘫痪；5，死亡。感染后3 d对卫星组小鼠实行安乐死，取后肢腿部肌肉30 mg，TRIzol法提取全RNA并反转录cDNA，利用实时荧光定量检测方法对特异性片段扩增并定量。所用引物序列编号为EV71-S1 （5'-AGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAG-3'）和EV71-A1（5'-TAGCATTTGATGATGCTCCAATTTCAG-3'）。

1.2.4 HE染色及免疫熒光分析 感染3 d后，卫星组小鼠给予安乐死，取后肢肌肉，10%福尔马林固定48 h，脱水后石蜡包埋，HE染色观察病理变化。免疫荧光染色利用抗EV71单克隆抗体（1∶500）作为一抗，4℃过夜，随后0.01 mol/L PBS清洗，鼠抗兔IgG（H+L）作为二抗（1∶200）孵育，0.01 mol/L PBS清洗后附荧光抗体，在激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果

2.1 LPS刺激后STAT1敲除小鼠血清细胞因子水平降低

对LPS刺激组的血清细胞因子定量分析发现，STAT1基因敲除小鼠的血清细胞因子水平出现不同程度降低。腹腔注射LPS 24 h后，对小鼠血清细胞因子进行定量分析的结果显示，STAT1基因敲除小鼠血清细胞因子的分泌水平都有不同程度的降低。与野生型小鼠相比，STAT1-/-小鼠细胞因子降低水平高于STAT1+/-小鼠，具体为：IL-1α（60.69%，P < 0.01）、IL-1β（91.92%，P < 0.01）、IL-6（79.93%，P < 0.05）、IL-10（56.66%，P < 0.01）、IL-12/IL-23p40（72.58%，P < 0.01）、TNF-α（62.03%，P < 0.01）以及Mouse MIP-1α（45.09%，P < 0.01）。在所检测细胞因子中，小鼠IL-1β的降低水平最为明显（P < 0.01）。见图1。

2.2 EV71感染后STAT1敲除小鼠症状加重

EV71感染后，与野生型STAT1+/-小鼠相比，STAT1-/-小鼠表现出更严重的临床症状、更高的死亡率以及更高的病毒载量。结果表明，EV71感染后，野生型小鼠在感染后6 d出现死亡，而STAT1-/-小鼠在感染4 d后出现死亡情况，死亡时间提前。感染6 d后STAT1-/-小鼠全部死亡，生存率为零，与其他组小鼠相比差异有高度统计学意义（P < 0.01）（图2A）。对感染EV71后小鼠出现的症状表现进行评分并统计发现，STAT1-/-小鼠在感染3 d后症状急剧恶化（斜率增加），与其他组相比症状表现更为严重（图2B）。伴随症状加重，STAT1-/-小鼠在感染3 d后的体重明显减轻，其他两组小鼠随时间变化体重逐渐增加（图2C）。对肌肉病毒载量检测结果显示，STAT1-/-小鼠的肌肉病毒载量明显高于野生型小鼠与STAT1+/-小鼠，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2D。

2.3 EV71感染后STAT1敲除小鼠组织损伤加重

利用HE染色对小鼠后肢肌肉的病理变化进行观察，利用免疫荧光技术对不同组小鼠后肢肌肉中EV71抗原的表达量进行了对比。400倍镜下对EV71抗原荧光染色结果显示，EV71抗原在小鼠后肢肌肉中有聚集现象，与野生型组相比，这种现象在STAT1-/-小鼠中更加明显（图3B），据此推测EV71在STAT-/-小鼠后肢肌肉中复制水平增高。与野生型及STAT1+/-相比，STAT1-/-小鼠表现出大片炎性细胞浸润与组织纤维化（图3A），组织损伤情况更为严重。见图3。从生存率、病毒载量、HE染色等检测指标可见，STAT1基因敲除小鼠抵抗EV71病毒感染复制的能力存在严重缺陷，可能是导致EV71病毒感染加重的原因。

3 讨论

通过LPS刺激对免疫相关的细胞因子检测结果进行分析，在LPS刺激后STAT1-/-小鼠免疫相关细胞因子分泌水平降低，与之前报道的结论[15]。本研究证实STAT1基因敲除可以对C57BL/6小鼠的免疫系统产生影响。STAT1作为一种转录因子，可以通过与其它的转录因子结合后，激活或抑制[16]，其表达调控过程比较复杂。STAT1的作用包括诱导CXCL9、P21WAF1/CIP1、IFI205等基因的表達[17]，直接诱导MCP1等趋化因子产生[18]，以及与NF-κB协同参与免疫调节[19]等等。LPS刺激后，STAT1-/-小鼠与STAT1+/-小鼠的白介素、TNF-α、MIP-1α等细胞因子水平下调，且STAT1-/-小鼠下调的程度高于STAT1+/-小鼠，证明STAT1参与了小鼠免疫应答。

有研究报道，IL-1β基因转录可以通过JAK/STAT信号途径进行调控[20]。在本实验中，STAT1-/-小鼠的血清IL-1β因子在LPS刺激下其分泌水平下调了90%以上，差异有高度统计学意义（P < 0.01），推测可能是由于STAT1信号通路的影响引起IL-1β转录水平下调所导致的。

本实验证实，STAT1基因敲除可以导致小鼠对EV71的敏感性增高。EV71病毒感染STAT1基因敲除小鼠后，其生存率、体重水平明显降低，症状严重程度及病毒载量显著增高，肌肉病理损伤更加严重，免疫荧光染色结果也可以观察到EV71抗原在STAT1-/-小鼠肌肉的聚集水平升高。在整体动物水平上印证了之前报道过的关于EV71感染实验的结论[13]。

STAT1在细胞因子调节网络中扮演重要的角色，STAT-/-小鼠模型的构建，对研究机体免疫功能提供了强有力的研究工具。现已证实STAT1基因的缺失导致小鼠对EV71的敏感性增高。本实验从动物整体水平上探索了STAT1在抗EV71感染中的作用，可以为今后减少病毒复制及控制感染症状等治疗提供可靠的数据基础。

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（收稿日期：2017-01-27 本文編辑：苏 畅）