小尾寒羊MyoG外显子2和MyoD 5′侧翼区的多态性研究

王 旭，白俊艳，杨又兵，雷雪芹，庞有志，李宏伟,王欢玲，汤昱琳，邵俊红，阴怀源

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003)

小尾寒羊MyoG外显子2和MyoD5′侧翼区的多态性研究

王 旭，白俊艳*，杨又兵，雷雪芹，庞有志，李宏伟,王欢玲，汤昱琳，邵俊红，阴怀源

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003)

采用PCR-SSCP技术分析了小尾寒羊肌细胞生成素MyoG基因外显子2和生肌决定基因MyoD5′侧翼区的多态性，结果表明：MyoD5′侧翼区在小尾寒羊中检测到2种基因型(BB、AB)，BB和AB基因型频率分别为0.975 0和0.025 0，A和B等位基因频率分别为0.012 5和0.987 5；小尾寒羊的MyoG外显子2不存在多态性。对MyoD5′侧翼区的BB基因型测序分析发现，其与牛的MyoD1基因序列(XM_592330.2)相比，发生了2处突变，分别是第960位发生了T→C突变、第972位发生了C→A突变。

小尾寒羊；MyoG外显子2；MyoD5′侧翼区； PCR-SSCP

生肌调节因子(myoGenic regulatory factors,MRFs)，亦称生肌决定因子家族(myoGenic determining factors,MDFs)。生肌调节因子基因家族调控着畜禽的整个肌肉发育过程，从肌细胞的定型、增殖及肌纤维的形成，直到个体出生后的肌肉成熟和功能的完善，都有生肌调节因子的参与[1]。MRFs基因家族编码4种不同的肌肉特异性转录因子：生肌决定因子(myoGenic determining factor,MyoD)、肌细胞生成素(myoGenin,MyoG)、生肌调节因子5(myoGenic factor 5,myf5)和生肌调节因子4(muscle regulatory factor 4,mrf4)[2]。MyoG基因是MRFs基因家族中唯一在所有骨骼肌细胞均可表达的基因，是骨骼肌分化所必需的因子，其功能不可被其他生肌调节因子所代替，控制着整个肌肉的发育过程[3-4]。

目前，国内外对MyoD基因编码区研究较多，在绵羊、山羊方面主要集中于该基因家族中相关基因与羊生产性能的关联性研究。马海玉等[5]在新疆阿勒泰羊MyoD-P2基因座(外显子1)发现的A→G突变是导致其氨基酸由组氨酸变为丙氨酸的重要原因，该突变与阿勒泰羊产肉性状密切相关。MyoD5′侧翼区的多态性分析与羊生长性能指标关联性研究较少，国内仅李伟等[6]通过构建过表达MyoD基因，将其终止密码子TGA定点突变为GGA，获得MyoD异位表达细胞株。MyoD5′侧翼区的多态性研究在其他动物上较多，饶友生等[7]以白来航鸡、隐性白洛克鸡、杏花鸡、丝羽乌骨鸡、固始鸡、红色原鸡为材料，扩增全长为8 399 bp的序列，分析得到SNP的总数为161个，平均每52 bp出现1个SNP。这说明该区域在分子进化和系统发生过程中承受着比内含子区域更大的选择压，具有重要的研究意义。MyoG的调控序列和内含子相关基因在猪[8-9]、牛[10-11]、山羊[12-13]上的报道较多，而MyoG基因在绵羊上报道较少。鉴于此，利用PCR-SSCP技术检测了MyoG外显子2和MyoD5′侧翼区在小尾寒羊群体中的多态性，旨在为小尾寒羊的进一步选育改良奠定基础。

1 材料和方法

试验在河南科技大学动物科技学院动物遗传与育种实验室完成，供试样品(血液)采于河南省濮阳市台前县农户饲养的小尾寒羊。

1.1 材料

选择成年小尾寒羊40只，试验群体健康无病，饲养管理条件相同，取羊只颈静脉血液10 mL，采用ACD法抗凝，-20 ℃保存。DNA提取采用生工生物工程(上海)股份有限公司全血DNA试剂盒(SK1262)的操作方法进行。

1.2MyoG外显子2 和MyoD5′侧翼区引物设计

MyoG外显子2采用文献[13]的引物，MyoD5′侧翼区采用文献[9]的引物，具体见表1。引物由郑州鼎国生物技术有限公司合成。

表1 MyoG外显子2 和MyoD 5′侧翼区的引物

1.3MyoG外显子2 和MyoD5′侧翼区PCR扩增

PCR扩增反应体系的总体积为15 μL，其中去离子水5.3 μL，上游引物和下游引物各0.6 μL，DNA模板1.0 μL，2×TaqPCR Green Mix为7.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火温度条件下退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.4MyoG外显子2 和MyoD5′侧翼区SSCP分析

将6 μL的PCR扩增产物与6 μL变性液混合，加入石蜡油封严，放入98 ℃水浴锅中加热10 min，加热后立即放入冰盒中降温5～10 min。然后将PCR产物在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，稳压120 V电泳8 h，电泳结束后进行固定、染色、显影，凝胶成像系统拍照。

1.5 基因频率和基因型频率计算

某一基因位点上有A和B共2个等位基因，基因频率为p和q,则p=(2AA+AB)/2N；q=(2BB+AB)/2N。

某一基因位点上有A和B共2个等位基因，基因型频率为D、H和R,则D=AA型个体数/N；H=AB型个体数/N；R=BB型个体数/N。

式中：N表示群体中样本的总数。

1.6MyoD5′侧翼区测序

将小尾寒羊的MyoD5′侧翼区的纯合基因型BB和AA个体的PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序，应用DNAStar软件和SeqMan程序对测序结果进行分析。

2 结果与分析

2.1MyoG外显子2 和MyoD5′侧翼区PCR-SSCP分析结果

对小尾寒羊的MyoG外显子2和MyoD5′侧翼区PCR产物进行SSCP分析(图1、图2)可知，MyoD5′侧翼区在小尾寒羊中检测到2种基因型，分别定义为BB(图1中1、3、4、5、6的基因型)和AB基因型(图1中2的基因型)。MyoG外显子2在小尾寒羊中只检测到1种基因型，定义为AA基因型，因此，其在小尾寒羊中没有多态性。

2.2MyoG外显子2 和MyoD5′侧翼区群体遗传结构分析

由表2可以看出，MyoD5′侧翼区在小尾寒羊中以BB基因型为主，BB基因型频率为0.975 0，只检测到1只小尾寒羊的基因型为AB基因型，其频率仅为0.025 0，在小尾寒羊中MyoD5′侧翼区的A和B等位基因频率分别为0.012 5和0.987 5。而MyoG外显子2在小尾寒羊中只检测到1种基因型，定义为AA基因型，其AA基因型频率为1.000 0。

1、3、4、5、6为BB基因型；2为AB基因型

图2 小尾寒羊MyoG外显子2扩增片段的SSCP分析

基因只数基因型频率AABBAB等位基因频率ABMyoD5'侧翼区400.0000(0)0.9750(39)0.0250(1)0.01250.9875MyoG外显子2401.0000(40)0.0000(0)0.0000(0)1.00000.0000

注：括号内表示相应基因型的羊只数。

2.3MyoD5′侧翼区PCR产物的序列分析结果

将小尾寒羊MyoD5′侧翼区的基因序列在NCBI网站上进行同源性比对分析，其测序结果与牛的MyoD1基因序列(XM_592330.2)进行比对发现，MyoD5′侧翼区的BB基因型序列在第960位发生了T→C突变，在第972位发生了C→A突变(图3)。

图3 小尾寒羊MyoD 5′侧翼区的BB基因型测序结果

3 结论与讨论

孙伟等[14]研究表明，湖羊MyoG基因在2日龄时表达量最低，在30日龄之前，其表达量随着日龄的增加而增加，在30日龄后下降，且MyoG基因表达水平与宰前活质量、胴体质量、净肉质量均呈正相关。说明MyoG基因的表达对物种生产性能和发育有影响，因此，研究MyoG基因的外显子多态性有重要意义。刘铮铸等[15]对波尔山羊MyoG基因的鉴定和序列分析结果表明，波尔山羊MyoG基因包括3个外显子、3个内含子及部分5′UTR(74 bp)和3′UTR(260 bp)区，编码序列长675 bp，共编码224个氨基酸。刘永斌等[16]研究结果表明，蒙古羊、无角陶赛特羊、德国肉用美利奴羊和白萨福克羊MyoG基因外显子2所扩增的片段中不存在多态性，与本研究结果一致。此外，刘永斌等[16]还发现，MyoG外显子1所扩增的片段中存在3种基因型(AA型、AB型和BB型)，在4个绵羊品种中，蒙古羊的AA基因型频率最高，A等位基因频率明显高于B等位基因频率。这与本试验中小尾寒羊外显子2的主要基因型为AA基因型的结果类似，从而推测MyoG外显子1和外显子2在结构和功能上可能具有相似之处。同样的结果在储明星等[17]的研究中也有报道。综上表明，MyoG基因外显子1在绵羊、山羊群体中的主要表现型与A基因频率有关，控制MyoG主导基因频率对今后绵羊、山羊分子育种具有指导意义。

朱砺等[18]研究表明，MyoD基因内含子1内的DdeⅠ酶切位点，多态性较丰富，突变型A基因对猪的胴体性状和胴体等级性状影响较大，可极显著增加胴体瘦肉率和眼肌面积，降低皮脂含量，提高腿臀比例，增加胴体长度，同时会降低猪肉品质。田璐等[10]对3个黄牛和4个杂交肉牛品种MyoD基因第2内含子进行检测共发现2个SNP，且这2个多态位点对胴体性状的影响达到显著或极显著水平。黄萌等[11]在3个牛品种MyoD基因外显子3中检测到1个错义突变，该位点对肉牛的背膘厚、大腿肉厚的影响分别达到极显著和显著水平。在山羊上仅张海军等[12]研究发现，2个山羊品种MyoD5′侧翼区不同基因型个体的体尺性状差异均不显著。本研究发现，小尾寒羊的MyoD5′侧翼区具有多态性，主要表现为AB和BB基因型，而且以BB基因型为优势基因型。这与张海军等[12]的报道不一致。另外，本研究还发现，小尾寒羊MyoD5′侧翼区BB基因型在第960位发生了T→C突变，在第972位发生了C→A突变，没有检测到第970、1 001位发生C→T突变。其原因可能是山羊、绵羊为不同物种。本研究只检测了MyoD5′侧翼区和MyoG外显子2的多态性，结果发现，MyoD5′侧翼区2种基因型频率分布不均衡，主要以BB基因型为主，所检测到的2个突变位点对绵羊的生长发育及肉质性状有何影响，需要进行后续研究。

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Study on the Polymorphism ofMyoGExon 2 andMyoD5′Flanking Region of Small Tail Han Sheep

WANG Xu,BAI Junyan*,YANG Youbing,LEI Xueqin,PANG Youzhi,LI Hongwei,WANG Huanling,TANG Yulin,SHAO Junhong,YIN Huaiyuan

(College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

The polymorphism of theMyoGexon 2 and theMyoD5′ flanking region of the myoGenic decision gene were analyzed by PCR-SSCP in the Small Tail Han sheep breeds.The results showed that theMyoD5′flanking region in the Small Tail Han sheep had 2 genotypes (BB,AB),BB and AB genotype frequencies were 0.975 0 and 0.025 0,A and B allele frequencies were 0.012 5 and 0.987 5.The polymorphism ofMyoGexon 2 was not detected in the Small Tail Han sheep.Compared with the cattle’sMyoD1 gene sequence(XM_592330.2),BB genotype analysis of theMyoD5′ flanking region revealed two mutations,the T→C mutation occurred at the 960th position,and the C→A mutation occurred at the 972th position.

Small Tail Han sheep;MyoGexon 2;MyoD5′ flanking region; PCR-SSCP

2016-12-28

国家自然科学基金项目(31201777)；河南科技大学大学生研究训练计划(SRTP)项目(2013246)

王 旭(1992-)，男，河南平顶山人，在读硕士研究生，研究方向：动物遗传育种。E-mail:1615602774@qq.com

*通讯作者：白俊艳(1975-)，女，内蒙古赤峰人，副教授，博士，主要从事绵羊分子育种研究。E-mail:junyanbai@163.com

S813.3;S826

A

1004-3268(2017)06-0138-04