苹果叶部病害的傅里叶变换红外光谱鉴别研究

杨春艳，陈 英，刘 飞*，胡 琼

(1.玉溪师范学院 物理系，云南 玉溪 653100； 2.云南农业职业技术学院 生物工程系，云南 昆明 650212)

苹果叶部病害的傅里叶变换红外光谱鉴别研究

杨春艳1，陈 英1，刘 飞1*，胡 琼2

(1.玉溪师范学院 物理系，云南 玉溪 653100； 2.云南农业职业技术学院 生物工程系，云南 昆明 650212)

为建立一种基于傅里叶变换红外光谱技术结合光谱检索和逐步判别分析的苹果叶部病害快速鉴别方法，以白粉病、花叶病、炭疽叶枯病和早期落叶病4种病害,共60份样本的红外光谱、一阶导数光谱和二阶导数光谱为指标，利用Omnic 8.5 软件中光谱检索功能依次与相应光谱库进行检索鉴别。检索结果显示：基于一阶导数光谱和二阶导数光谱的检索正确率均为96.7%，高于基于红外光谱检索的83.3%。同时，以样品光谱差异较大的1 800～1 000 cm-1波数内的二阶导数红外光谱数据作为判别变量，利用SPSS 20.0软件中的逐步判别分析功能，比较了基于5种挑选判别变量方法建立的判别模型的鉴别效果。鉴别结果显示：采用Mahalanobis 距离逐步判别法建立的模型对苹果叶部病害的鉴别效果最好，对训练样本的回判正确率为100.0%，对测试样本的预测正确率为80.8%，总正确率最高，为92.3%。综上表明，傅里叶变换红外光谱技术结合光谱检索法或逐步判别分析法，均能较好地诊断苹果叶部病害种类，可为苹果叶部病害的鉴别和诊断提供一种省时、易行的方法。

苹果病害； 鉴别； 傅里叶变换红外光谱； 光谱检索； 逐步判别分析

苹果性味温和，含有丰富的糖类、有机酸、纤维素、维生素、矿物质、多酚等人体所需的营养物质，是公认的营养程度较高的健康水果之一。生产中，各类细菌、真菌和病毒引起的病害使苹果的产量和品质受到严重影响，给果农带来巨大的经济损失。因此，及时、准确地诊断病害，对提高苹果的产量和质量具有重要意义。

目前，苹果病害的鉴别主要是通过技术人员到现场，根据病株的发病部位、时期、病斑形状和颜色等诊断，存在主观性强、误差大的缺点。生物学检测、生理生化测定等方法虽然准确性高，但需进行病原分离、培养等一系列复杂过程，操作繁琐、耗时长、成本高。傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术以准确性高、制样简单、速度快、成本低等优点，已经用于植物病虫害的鉴别，如李志永等[1]基于FTIR技术，利用主成分分析的方法研究鉴别了不同的蚕豆病害，刘飞等[2]通过FTIR技术结合判别分析方法对蚕豆病虫害进行了鉴别研究，任先培等[3]利用FTIR技术结合相关性分析的方法对烟叶病害进行了鉴别研究，刘艳等[4]通过FTIR技术结合聚类分析的方法对柳树病叶进行研究，但利用FTIR技术对苹果病害进行研究，同时利用光谱检索的方法对植物病害进行鉴别均未见报道。因此，基于苹果病害叶片样品的傅里叶变换红外光谱及其一阶导数光谱和二阶导数光谱，分别采用光谱检索、逐步判别分析的方法对苹果叶部病害进行鉴别研究，以期为苹果叶部病害的及时、准确诊断提供思路。

1 材料和方法

1.1 样品采集与制备

试验用白粉病、花叶病、炭疽叶枯病和早期落叶病4种苹果病害叶片均采自昭通市昭阳区洒渔乡果园，每类病害各取15片叶，共60个样本。采集的叶片经洗净、晾干，测试前放入烘箱中以40 ℃恒温烘至恒质量。测试光谱时，避开主叶脉取样。样品放入玛瑙研钵磨为均匀细粉后，按样品和溴化钾1∶70的质量比加入溴化钾搅磨均匀，压片测试光谱。每个叶片样品压制1个扫描片。

1.2 试验仪器

试验所用仪器为PE公司生产的Frontier型傅里叶变换红外光谱仪，装备DTGS探测器，光谱扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，累加扫描次数为16次。

1.3 试验方法

所有测试所得光谱均已扣除背景，在Omnic 8.5软件中进行自动基线校正、平滑和纵坐标归一化处理，计算了各样品红外光谱的一阶导数光谱和二阶导数光谱，以及各类样品的平均红外光谱及其一阶导数光谱和二阶导数光谱，并依次建立Lib1、Lib2、Lib3 共3个光谱库。

1.3.1 光谱检索方法 光谱检索是一种将未知类别物品的光谱与光谱库中谱图进行逐点扫描，以找到最佳匹配，从而鉴别未知物类别的方法，匹配得分越高，说明相似度越高。鉴别中，未知分类样品光谱与光谱库中已知分类的光谱匹配得分最高的，即视为同类[5]。

Omnic 8.5 软件中光谱检索功能模块共设置有专家检索、相关性检索、绝对差检索、绝对微分差检索、平方差检索和平方微分差检索6种检索算法，其中绝对微分差检索算法对特征性差的波谱带不敏感，对信噪比差的未知物光谱检索较为有利[6]，故本试验选择用绝对微分差检索算法进行苹果叶部病害类型的鉴别。

1.3.2 逐步判别分析法 基于样品的二阶导数光谱数据，通过SPSS 20.0软件中的逐步判别分析，按照Fisher函数系数选择方法，建立判别模型进行苹果叶部病害类型的鉴别。判别分析中，在每类病害样品中任意选择9个样本作为训练样本，余下的6个样本作为测试样本，即共有36个训练样本，24个测试样本；使用的光谱数据在1 800～1 000 cm-1波数。

2 结果与分析

2.1 苹果病害叶片的红外光谱特征

从图1可明显看出，苹果各类病害叶片的红外光谱非常相似。在4 000～700 cm-1波数内，显示了3 343、2 927、2 858、1 726、1 626、1 518、1 447、1 375、1 314、1 247、1 208、1 167、1 073、894、831、778 cm-1附近共16个主要吸收峰。3 343 cm-1附近强且宽的吸收峰来自多糖中O-H的伸缩振动吸收和蛋白质中N-H伸缩振动吸收的叠加，为光谱的最强峰；2 927、2 858 cm-1附近吸收峰来自甲基和亚甲基中C-H反对称和对称伸缩振动吸收。在1 800～1 500 cm-1波数内C=O和C-O混合振动区，1 726 cm-1附近吸收峰归属脂类中C=O伸缩振动；1 626 cm-1附近的强吸收峰归属木质素中与苯环相连的C=O的伸缩振动吸收[7]和草酸钙中C-O反对称伸缩振动吸收[8]以及蛋白质酰胺Ⅰ带中C=O伸缩振动吸收的叠加峰；1 518 cm-1附近弱吸收峰归属木质素中与苯环相连的C=O的伸缩振动吸收。在1 500～1 200 cm-1波数内蛋白质、木质素和纤维素等多糖中C-H、C-O、C-O-C振动的混合吸收区，1 447、1 375 cm-1附近吸收峰归属木质素中甲基的反对称弯曲振动[9]和纤维素中甲基的对称弯曲振动；1 314 cm-1附近吸收峰来自纤维素、木质素、蛋白质等受氧、氮原子影响的甲基和亚甲基对称弯曲振动吸收[3]和草酸根负离子中C-O反对称伸缩振动吸收的叠加峰[8]；1 247 cm-1附近弱吸收峰为木质素中苯烃基C-O的伸缩振动吸收和蛋白质酰胺Ⅲ带吸收的叠加峰；1 208 cm-1附近弱吸收峰归属木质素中C-O-C伸缩振动。1 200～700 cm-1波数是纤维素等多糖中C-H弯曲振动、C-O-C和C-O伸缩振动以及草酸根中C-O弯曲振动的混合吸收区。1 167、1 073 cm-1附近吸收峰归属纤维素中C-O-C和C-O的伸缩振动吸收；894、831 cm-1附近弱吸收峰归属纤维素中C-H剪式振动吸收和木质素中C-H面内弯曲振动吸收；778 cm-1附近弱吸收峰归属草酸根中C-O弯曲振动吸收。上述光谱特征表明，苹果叶片光谱主要由纤维素、木质素、蛋白质和脂类化合物的吸收带组成。

A、B、C、D依次为白粉病、花叶病、炭疽叶枯病、早期落叶病，下同

2.2 苹果病害叶片的光谱差异

尽管不同苹果病害叶片的红外光谱吸收峰的峰形、峰位和峰强非常相似，但在1 800～1 000 cm-1波数仍存在部分差异，根据这些差异可以对苹果叶部病害进行鉴别。从表1可知，不同病害叶片的光谱差异主要表现在：(1) 在反映脂类中C=O伸缩振动吸收的1 726 cm-1附近，只有炭疽叶枯病叶片的红外光谱未显示明显的吸收峰；(2)在反映纤维素中甲基对称弯曲振动吸收的1 375 cm-1附近，只有花叶病叶片的红外光谱未显示吸收峰；(3) 白粉病叶片光谱在1 208 cm-1附近显示了弱的吸收峰，花叶病、炭疽叶枯病、早期落叶病叶片光谱未显示此峰；(4)在反映纤维素和半纤维素中C-O-C伸缩振动吸收的1 167 cm-1附近，只有早期落叶病叶片光谱未显示明显的吸收峰；(5)在反映木质素中C=O伸缩振动吸收和草酸钙中C-O反对称伸缩振动吸收的叠加峰处(1 626 cm-1附近)，除早期落叶病叶片光谱的吸收峰为强峰外，其余均为极强峰;(6)早期落叶病叶片光谱在1 447 cm-1附近显示了弱的吸收峰，其余均显示中等强度吸收峰；(7)在反映木质素中苯羟基C-O的伸缩振动和蛋白质酰胺Ⅲ吸收的叠加峰处(1 247 cm-1附近)，白粉病和炭疽叶枯病叶片的光谱显示了中等强度的吸收峰，花叶病和早期落叶病叶片光谱则显示了弱吸收峰。

表1 1 800～1 000 cm-1波数内苹果病害叶片的红外光谱吸收带 cm-1

注：vs—极强；s—强；m—中等；w—弱；vw—极弱。

从上述分析可看出，依靠光谱图上几个特征吸收峰，可以粗略地将白粉病、花叶病、炭疽叶枯病、早期落叶病叶片的光谱区别开，为更准确地区分4种病害，本研究基于4类样品的红外光谱进行了光谱检索鉴别和逐步判别分析鉴别。

2.3 苹果叶部病害的红外光谱检索鉴别

对全部60份样品的红外光谱、一阶导数光谱和二阶导数光谱分别与相应光谱库进行绝对微分差算法检索，结果显示，未知分类样品的红外光谱和导数光谱与相应光谱库的检索匹配正确率均较高。未知分类样品的红外光谱与光谱库Lib1的检索结果中，匹配正确的有50个，匹配正确率为83.3%；未知分类样品红外光谱的一阶导数光谱与光谱库Lib2的检索和二阶导数光谱与光谱库Lib3的检索结果中，均有58个匹配正确，匹配正确率均为96.7%。表2中列出了未知分类样品的红外光谱及其导数光谱与相应光谱库的检索中，分类不正确的样品和得分高的前3个病害类型及得分，3种光谱数据类型检索均正确的47份样品的检索鉴别信息未列出。

比较分析未知分类样品的红外光谱及其导数光谱分别与相应光谱库进行绝对微分差算法检索的结果，主要有以下4个特点：(1)检索得分依次按未知分类样品的红外光谱与光谱库Lib1、一阶导数光谱与光谱库Lib2和二阶导数光谱与光谱Lib3进行检索的顺序由高到低排列。(2)未知分类样品的红外光谱与光谱库Lib1的检索匹配正确率低于一阶导数光谱与光谱库Lib2和二阶导数光谱与光谱Lib3进行检索的正确率。(3)未知分类样品的红外光谱与光谱库Lib1的检索分类中错误的10个样品，在一阶导数红外光谱与光谱库Lib2的检索和二阶导数与光谱库Lib3的检索分类中均匹配正确。(4)未知分类样品的红外光谱与光谱库Lib1的检索分类中匹配正确的A12、D1和D5 样品，D1在一阶导数光谱和二阶导数光谱与相应光谱库的检索分类中均匹配错误；A12在基于一阶导数光谱的检索中匹配正确，在基于二阶导数光谱的检索中匹配错误，D5的情况则恰好和A12相反。

表2 基于不同类型光谱检索鉴别中分类不正确的样品

注：鉴别结果中，代表病害类型字母后的数字表示光谱检索鉴别中的得分；斜体表示基于该类数据的检索分类是正确的。

上述特点与导数光谱有利于在吸收光谱急剧变化区域中确定被掩盖的弱吸收的存在和确定重叠峰处吸收带的数目[10]，实现放大光谱差异的特征相吻合，从而一方面降低了未知分类样品的导数光谱与光谱库中谱图的亲密程度，也即降低了匹配得分，另一方面，使得在基于红外光谱的检索中匹配错误的部分样品在放大了差异的导数光谱的检索中匹配正确。此外，由于导数光谱在放大光谱差异的同时，也降低了光谱的信噪比，使得在基于红外光谱的检索中匹配正确的个别样品在导数光谱的检索中匹配错误。总体来看，基于3种类型的光谱进行光谱检索匹配来鉴别苹果叶部病害都是可行的，且导数光谱更合适。

2.4 苹果叶部病害的逐步判别分析鉴别

以样品光谱差异较大的1 800～1 000 cm-1波数内的二阶导数红外光谱数据作为判别变量，按步进式方法，分别选用Wilks’lambda 、未解释方差、Mahalanobis 距离、最小F值和Rao’s V 共5种挑选判别变量方式，依据Fisher线性准则挑选函数系数，建立苹果叶部病害类别的判别函数对样品进行判别。基于5种挑选判别变量方法建立的判别函数对样品的鉴别分类结果见表3，同时为了验证判别函数和模型的稳定性，对不同挑选变量方法建立的判别函数均采用5折交叉法进行验证。

表3 不同挑选判别变量方法对苹果叶部病害的鉴别结果

注：训练样本情况中，每种情况的训练样本总数均为36个，由每种病害样品中随机抽取9个样本组成；5种样本情况中，各样品至少有1次作为训练样本参与建模，至少有1次作为测试样本进行预测。

由表3可知，只有Mahalanobis 距离和最小F值2种挑选判别变量方法建立的判别函数在5种训练样本情况下对训练样本的回判正确率均为100.0%，其对测试样本的预测正确率存在差异，前者为80.8%，后者为79.2%，平均总正确率分别为92.3%和91.7%，依次为5种方法中总正确率最高和次高。选择Rao’s V 方法建立判别函数和模型时，预测正确率最低，为77.5%，平均总正确率也最低，为89.7%。

在同种挑选判别变量方法下，采用5折交叉验证的不同训练样本情况下对测试样本的预测正确率差异的大小，反映了该方法所建立的判别模型的稳定性[10]。5种训练样本情况下，选择最小F值方法时，对测试样本的预测正确率差异最小，为8.3%，说明最小F值方法建立的判别模型相对最稳定；选择Mahalanobis 距离方法时，对测试样本的预测正确率差异为12.5%，模型稳定性仅次于最小F值方法建立的模型。综合模型的稳定性、模型对测试样本预测的正确率和平均总正确率因素，基于样品红外光谱二阶导数光谱数据的判别分析方法能鉴别苹果叶部病害类型，其中Mahalanobis 距离逐步判别法诊断效果最好。

3 结论与讨论

本研究利用FTIR技术测试了4种苹果叶部病害共60份样品的红外光谱，通过Omnic 8.5 软件计算了各样品红外光谱的一阶导数光谱和二阶导数光谱，建立了分别由各类样品的平均红外光谱、一阶导数光谱、二阶导数光谱组成的光谱库。对各样品的红外光谱、一阶导数光谱和二阶导数光谱分别与相应光谱库进行绝对微分差算法检索，基于一阶导数光谱和二阶导数光谱检索的分类正确率均为96.7%，高于基于红外光谱的检索分类正确率，表明基于导数光谱的苹果叶部病害鉴别诊断效果较佳。以样品光谱差异较大的1 800～1 000 cm-1波数内的二阶导数红外光谱数据为判别变量，依据Fisher准则挑选函数系数，比较了基于5种判别变量挑选方法所建立的判别函数的鉴别效果和模型的稳定性，综合考虑模型的稳定性、模型对测试样本预测的正确率和平均总正确率等因素，Mahalanobis 距离逐步判别法建立的模型诊断效果最好， 平均总正确率达 92.3%。以上结果表明，FTIR技术结合光谱检索或FTIR技术结合逐步判别分析，可为苹果叶部病害诊断提供一种快捷、易行的方法。

光谱检索法和逐步判别分析法都是有监督的模糊识别统计方法，需要根据已知样本的分类情况，按照某种挑选指标的方法对未知分类的样本信息进行逐一检验，以实现分类鉴别。因此，无论使用光谱检索法还是逐步判别分析法进行分类鉴别，都必须掌握大批按某种特征分类的样本。苹果病叶的傅里叶变换红外光谱既包含病害信息，也包含品种、产地等信息，这些信息隐藏在样品光谱中并相互交织。因此，基于病害叶片的光谱进行病害类型鉴别分析时，若要建立好的模型，采集的样本量必须足够大，同种病害样品覆盖的品种和产地要多，且用以建立判别函数的训练样本应包含试验样本涉及的所有品种和产地。

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Identification of Apple Leaf Disease Type Based on Fourier Transform Infrared Spectroscopy

YANG Chunyan1,CHEN Ying1,LIU Fei1*,HU Qiong2

(1.Department of Physics,Yuxi Normal University,Yuxi 653100,China; 2.Department of Bioengineering,Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture,Kunming 650212,China)

Fourier transform infrared(FTIR)spectroscopy combined with spectra retrieval and stepwise discrimination analysis was used to identify the disease type of apple.The infrared spectra of 60 samples from 4 diseases(powdery mildew,mosaic disease,anthrax blight and early deciduous disease) were collected and the first-derivative spectra and second-derivative spectra for all samples were calculated by the software Omnic 8.5,and three spectra libraries were constructed,separately.The absolute differential difference search using the infrared spectra,first-derivative spectra and second-derivative spectra was carried out,respectively.Results showed correct rate of 96.7% for the first-derivative spectra and second-derivative spectra,and 83.3% for the infrared spectra.The second-derivative spectra in the range of 1 800—1 000 cm-1were used to build models by stepwise discrimination analysis.The discrimination effectiveness was compared for the five ways to choose discrimination variance,and results showed that the model based on Mahalanobis distance method was better for the identification of apple disease type.The correct rate of returned classification reached 100.0%,the predication accuracy was 80.8%,and the total correct rate was 92.3%.The results indicate that as a time-saving and convenient method,the FTIR spectroscopy combined with spectra retrieval or stepwise discrimination analysis is feasible to distinguish the diseases of apple.

diseases of apple; identification; Fourier transform infrared spectroscopy; spectra retrieval; stepwise discrimination analysis

2016-12-19

云南省教育厅基金项目(2013Y480)；玉溪师范学院青年教师资助计划项目

杨春艳(1979-)，女，云南大理人，副教授，硕士，主要从事激光红外光谱研究。E-mail：ychyky@163.com

*通讯作者：刘 飞(1974-)，男，云南玉溪人，副教授，硕士，主要从事激光红外光谱研究。 E-mail：yxtclf@163.com

S436.611.1;O657.33

A

1004-3268(2017)06-0156-05