辽宁地区猪源大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测与分析

梁 乔，赵凤菊，顾贵波，杨本勇，李井春，魏园园

(辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164)

辽宁地区猪源大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测与分析

梁 乔，赵凤菊*，顾贵波，杨本勇，李井春，魏园园

(辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164)

为了解辽宁地区猪源大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药情况，采用K-B纸片法对65株猪源大肠埃希菌菌株进行6种氨基糖苷类抗生素的药敏试验，同时采用PCR方法对耐药菌株rpsl基因和4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4进行检测及序列分析，并将阳性样品与GenBank中登录的序列进行同源性比较。结果显示，辽宁地区猪源大肠埃希菌对链霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素的耐药率分别为26.2%、15.4%、18.5%、29.2%、4.6%、21.5%；23株耐药菌株rpsl基因检出率为100%；4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4检出率分别为13.0%、8.7%、69.6%、4.3%。以上结果表明，在氨基糖苷类抗生素中耐药性最低的是丁胺卡那霉素，rpsl基因及氨基糖苷类钝化酶基因普遍存在于辽宁地区猪源大肠埃希菌中。

猪； 大肠埃希菌； 氨基糖苷类抗生素； 耐药基因；PCR

氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、妥布霉素、链霉素等因具有高效、广谱、药物动力强等优点，在临床中被广泛应用于人和动物细菌感染的治疗，这些药物主要通过破坏细菌细胞膜的完整性、多环节抑制细菌蛋白质的合成[1-2]。随着氨基糖苷类抗生素的不当使用，细菌耐药问题也日益突出，主要是由于细菌对氨基糖苷类药物吸收量的减少、产生氨基糖苷类钝化酶(aminoglycosides-modifyingenzymes,AMEs)以及核糖体结合位点的减少，其中产生氨基糖苷类钝化酶是细菌对氨基糖苷类抗生素耐药最重要的原因[3-4]。目前，革兰氏阴性菌对氨基糖苷类抗生素的耐药比率、耐药表型、耐药机制的研究成为热点，并且发现其耐药模式能够在不同种类的细菌间传播[5]。明确氨基糖苷类作用机制与细菌对氨基糖苷类耐药机制、掌握细菌的耐药基因流行情况显得尤为重要。鉴于此，研究辽宁地区65株猪源大肠埃希菌株对链霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和庆大霉素6种氨基糖苷类抗生素的耐药性，并运用建立的PCR检测方法对rpsl基因和4种氨基糖苷类钝化酶基因进行检测与序列分析，旨在掌握辽宁地区流行的主要氨基糖苷类耐药基因，进一步了解耐药的分子机制，从分子水平对大肠埃希菌菌株耐药及潜在耐药问题进行分析和推测，进而科学指导临床用药。

1 材料和方法

1.1 菌株

65株从辽宁各地区分离、鉴定的猪源大肠埃希菌，由辽宁省动物疫病预防控制中心保存。

1.2 主要试剂

链霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和庆大霉素药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。DNAzol试剂购自Invitrogen公司；ExTaqDNA聚合酶(5U/μL)、dNTP(2.5mmol/L)、溴化乙锭、DL2000DNAMarker、三羟甲基氨基甲烷核乙酸电泳缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司。其他试剂均为实验室常规试剂。

1.3 药敏试验

药敏试验采用K-B纸片扩散法，病原菌纯培养18～24h后，挑取纯培养菌落置于无菌生理盐水中，制成相当于0.5麦氏单位的菌悬液，用灭菌棉签蘸取适量均匀涂抹到MH琼脂培养基表面，反复几次，最后沿平皿周边绕2圈，贴好纸片后在37 ℃恒温培养箱中培养16～18h，测量药敏试纸在平板中产生的抑菌环直径，判定结果依据NCCLS标准进行。

1.4 耐药基因的PCR检测

1.4.1 引物设计及合成 根据GenBank上登录的氨基核苷类基因相应的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件设计并合成了5对特异性引物，序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及相关信息

1.4.2 细菌DNA模板的制备 将大肠埃希菌划线接种于麦康凯培养基，于37 ℃培养18～24 h后，挑选典型菌落，用灭菌生理盐水制备成0.5麦氏单位的菌悬液，按DNAzol试剂说明书提取基因组DNA-20 ℃保存备用。

1.4.3 PCR反应体系及条件 采用25 μL反应体系:灭菌去离子水16.375 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL，ExTaqDNA聚合酶0.125 μL，上、下游特异性PCR引物各1 μL，DNA 2 μL。反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。取6 μL扩增产物与1 μL上样缓冲液混合后，在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外凝胶成像仪下观察结果。

1.4.4 耐药基因PCR产物序列测定及分析 选取rpsl基因和4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4阳性样品进行扩增，将扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，并与GenBank基因库的相应基因序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 药敏试验检测结果

采用K-B纸片扩散法，对65株猪源大肠埃希菌进行氨基糖苷类药物药敏试验，结果显示，共23株对氨基糖苷类药物耐药，耐药率为35.4%(23/65)。其中，对卡那霉素的耐药率最高，为29.2%(19/65)；其次是链霉素26.2%(17/65)、庆大霉素21.5%(14/65)、新霉素18.5%(12/65)、妥布霉素15.4%(10/65)；对丁胺卡那霉素耐药率最低，为4.6%(3/65) (表2)。

表2 65株猪源大肠埃希菌药敏试验结果

2.2 耐药基因的PCR检测结果

2.2.1rpsl基因的PCR检测结果 对23株大肠埃希菌氨基糖苷类耐药菌株rpsl基因进行扩增，得到长度为374 bp的片段。

2.2.2 4种氨基糖苷类钝化酶基因的PCR检测结果 采用PCR方法对23株氨基糖苷类耐药菌株进行aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4四种钝化酶基因检测。由表3可知，23株氨基糖苷类耐药菌株aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4耐药基因总的检出率为73.9%(17/23)；aac(3)-Ⅳ的检出率为13.0%(3/23)，aadA的检出率为8.7%(2/23),aac(6′)-Ⅰb-cr的检出率为69.6%(16/23)，aacC4的检出率为4.3%(1/23)。其中，15株携带1种氨基糖苷类钝化酶基因，占所有菌株的65.2%(15/23)， 2株携带2种氨基糖苷类钝化酶基因,占所有菌株的13.0%(2/23)，仅有1株携带3种氨基糖苷类钝化酶基因，占所有菌株的 4.3%(1/23)，未发现同时携带4种氨基糖苷类钝化酶基因的菌株。

表3 23株大肠埃希菌中氨基糖苷类药物主要耐药基因携带情况

2.3 耐药基因的序列分析

将4种钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4阳性样品的测序结果与GenBank基因库的相应基因序列进行同源性分析发现，4种基因阳性样品的同源性分别为100%、99%、100%、99%，23株耐药菌株经rpsl基因测序后未发现突变。

3 结论与讨论

同时用表型与基因型方法分析辽宁地区大肠埃希菌对氨基糖苷类药物的耐药性，结果表明，辽宁地区分离的大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素存在普遍耐药性。通过表型研究发现，大肠埃希菌对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素等常用的氨基糖苷类抗生素耐药性较高，对丁胺卡那霉素的耐药性较低，这与前人的研究结果基本一致[4,6,7-8]。通过基因型研究发现，辽宁地区大肠埃希菌携带的主要氨基糖苷类钝化酶基因是aac(6′)-Ⅰb-cr，其次是aac(3)-Ⅳ、aadA、aacC4； rpsl基因在23株耐药菌株中均有携带，且未发现突变。

rpsl基因的作用是编码核糖体蛋白S12，核糖体蛋白S12也是链霉素等抗生素的作用位点。正常情况下，链霉素与S12蛋白结合后能够抑制细胞生长，rpsl基因突变则能使链霉素结合到核糖体上的能力降低，从而产生耐药性。rpsl基因主要突变位点在43位(AAG→AGG)和88位(AAG→AGG)，常见的突变类型为43位突变[7]。据报道，rpsl基因突变率较高，吴雪琼等[10]对57株结核分枝杆菌耐药基因型进行检测发现，rpsl基因突变率达82.3%；Tsai等[9]对127株耐药菌株通过测序的方法来鉴定rpsl基因突变，发现rpsl基因突变率可高达100%。本试验中23株菌株均检测出rpsl基因，且均未发生突变，证明辽宁地区猪源大肠埃希菌对链霉素的耐药不是由于rpsl基因突变导致的，链霉素耐药可能存在其他的耐药机制。

aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4四种基因属于氨基糖苷类钝化酶基因，因产生钝化酶而产生耐药性。不同地区检出的氨基糖苷类钝化酶的种类和检出率也有所不同。汤景元等[11]对我国19个省规模化猪场的大肠埃希菌进行耐药基因调查，检出主要钝化酶基因是aadA1和aaC2；于学辉等[12]对我国西南地区鸭源大肠埃希菌进行耐药基因调查，检出的主要钝化酶基因是ant(6″)-Ⅰa和ant(6″)-Ⅱa；孙慧等[6]对山东地区禽源大肠埃希菌进行耐药基因调查，检出主要钝化酶基因是ant(3″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、aph(3′)-Ⅱa。本试验中检出辽宁地区大肠埃希菌携带的主要氨基糖苷类钝化酶基因是aac(6′)-Ⅰb-cr。aac(6′)-Ⅰb-cr属于变异基因，首次在假单胞菌属中被发现[13]，随后在国内外相关报道较多[14-17]。本研究结果表明，aac(6′)-Ⅰb-cr基因在氨基糖苷类耐药菌株中检出率较高，这与前人研究结果一致。aac(3)-Ⅳ基因是至今为止唯一被确定的能够引起庆大霉素、安普霉素交叉耐药的基因，相关研究结果显示，大约26%的庆大霉素耐药大肠埃希菌分离株携带该基因[18-19]；aadA基因主要对链霉素进行钝化修饰，能够通过耐药质粒在细菌间进行耐药基因的扩散与传播[20]；aacC4基因在大肠埃希菌中编码AAC(3)-Ⅳ氨基糖苷乙酰转移酶，AAC(3)-Ⅳ氨基糖苷乙酰转移酶对安普霉素、卡那霉素、庆大霉素、潮霉素及其他几种氨基糖苷类抗生素均有抑制作用[21]。

抗生素的持续使用引起了细菌的选择性进化压力，产生抗生素耐药菌，反过来又导致细菌病治疗失败和发病率的提高[22-24]。因此，对耐药基因的研究能够从分子水平上对其耐药机制进行推测，且能够及时发现耐药基因的变异等问题[25]，对辽宁地区猪源大肠埃希菌感染的控制与治疗具有重要意义。

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DetectionandAnalysisofResistanceGenestoAminoglycosideAntibioticsamongSwineEscherichia coliStrainsinLiaoningArea

LIANGQiao,ZHAOFengju*,GUGuibo,YANGBenyong,LIJingchun,WEIYuanyuan

(PreventionandControlCenterofLiaoningProvinceAnimalEpidemicDisease,Shenyang110164,China)

In order to investigate the aminoglycoside resistance ofEscherichiacoliisolated from swine in Liaoning,the drug sensitivity to six kinds of aminoglycosides antibiotics in 65 strains ofE.coliwere analyzed by K-B method.Meanwhile,PCR was used to detect and analyze the sequences of therpslgene as well as four aminoglycoside modifying enzyme genes includingaac(3)-Ⅳ,aadA,aac(6′)-Ⅰb-crandaacC4.Thehomologouscomparisonwereprocessedamongthedetectedgenesfromtheaminoglycoside-resistantstrainswiththesequencespublishedinGenBank.Theresultsindicatedthattheresistanceratestostreptomycin,tobramycin,neomycin,kanamycin,amikacinandgentamicinwere26.2%,15.4%,18.5%,29.2%,4.6%and21.5%,respectively.Inalltwenty-threeaminoglycoside-resistantstrains,thedetectionrateofrpslwas100%,andthedetectionratesofaac(3)-Ⅳ,aadA,aac(6′)-Ⅰb-crandaacC4were13.0%,8.7%,69.6%and4.3%,respectively.TheseresultssuggestedthattheseE.colistrainspresentedlowestaminoglycosideresistancetoamikacin,andalsorpslgeneandaminoglycosidemodifyingenzymegeneswerecommonlyfoundinE.coliisolatedfromswineinLiaoning.

swine; Escherichia coli;aminoglycosideantibiotics;drugresistancegene;PCR

2017-01-12

辽宁省自然科学基金项目(201402573)

梁 乔(1991-)，女，辽宁庄河人，助理兽医师，本科，主要从事畜病检验工作。E-mail:15242494959@163.com

*通讯作者：赵凤菊(1978-)，女，河北廊坊人，高级兽医师，硕士，主要从事动物人畜共患病的防控与研究。 E-mail:fengjuzho2003@163.com

S

A

1004-3268(2017)06-0134-04