牛羊肝片吸虫病实时荧光PCR检测方法的建立

王彩霞林祥梅吴绍强*徐赓

（1.中国检验检疫科学研究院北京100029；2.山东省沂南县畜牧兽医局）

牛羊肝片吸虫病实时荧光PCR检测方法的建立

王彩霞1林祥梅1吴绍强1*徐赓2

（1.中国检验检疫科学研究院北京100029；2.山东省沂南县畜牧兽医局）

选择肝片吸虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计引物和TaqMan探针，通过对反应体系和反应条件进行优化，建立了实时荧光定量PCR检测肝片吸虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为1×100-1×106拷贝，敏感度可检测到1拷贝质粒DNA，而且与华支睾吸虫、姜片吸虫、卫氏并殖吸虫无交叉反应，特异性良好。以所建立的方法检测虫卵可以检测到2个肝片吸虫卵囊。结果表明，本研究所构建的牛羊肝片吸虫病实时荧光PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点，可满足养殖场和口岸牛羊及其肉制品肝片吸虫的检测需要。

肝片吸虫；实时荧光PCR；敏感性；特异性；检测

1 前言

肝片吸虫是危害牛羊等反刍动物最主要的寄生虫之一，属扁形动物门（Platyhelminthes）、吸虫纲（Trematoda）、复殖目（Digenea）、片形科（Fascilolidea）、片形属（Fasciola）。虫体主要寄生于黄牛、水牛、绵羊、山羊、鹿和骆驼等反刍动物的肝脏胆管中，也寄生于猪和马属动物，还可感染猫、狗、猪、兔等多种野生动物[1]。因此，肝片吸虫病是家畜及多种食草动物和野生动物的寄生虫病，亦可感染人，属人畜共患寄生虫病。该病在世界各地均有发生，在我国的32个省市自治区都有发生，尤以畜牧业发达的内蒙、吉林、青海、宁夏等地区最严重[2]。肝片吸虫病是农业部《一二三类动物疫病病种名录》中的三类动物疫病，也列入了《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》（第〔2013〕号）中。

肝片吸虫病的病原包括肝片吸虫和大片吸虫2种，在非洲、东南亚以及我国等地区这两种病原同时存在，而且这两种病原危害同等严重，从虫卵形态、免疫学等方面难以区分。目前，对该病的诊断只能根据流行病学资料、临床症状、病理变化及粪便检查等进行综合判定，常常容易造成误诊。近几年来，随着免疫学和分子生物学技术的发展，不少学者在免疫学诊断和分子生物学检测等方面开展了大量研究，使得对该病的诊断有了新的进展[3]。实时荧光定量PCR技术将荧光染料或荧光探针加入到PCR反应体系中，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点，目前已成为动物病原检测的重要方法[4]。本研究拟建立牛羊肝片吸虫基因组DNA的荧光定量PCR检测方法，用于牛羊肝片吸虫病的检测以及虫卵的鉴别诊断。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样本

新鲜肝片吸虫：由广西大学陈汉忠教授惠赠；对照样品：华支睾吸虫（clonorchis sinensis）由上海出入境检验检疫局李树清赠送，姜片吸虫（fasciolopsis）、卫氏并殖吸虫（paragonimus westermani）由本实验室保存。

2.1.2 试剂

DNA提取试剂盒：购自QIAGEN公司；PCR产物胶回收试剂盒：购自OMEGA公司；DNA扩增试剂盒、DNA Marker、克隆载体pMD18-T、JM109感受态细胞、Dilution Buffer：均购自TaKaRa公司。

2.2 方法

2.2.1 肝片吸虫阳性克隆质粒的构建

2.2.1.1 虫体基因组DNA的提取

取肝片吸虫虫体25 mg，按DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA，-20℃保存备用。

2.2.1.2 引物设计与合成

选取肝片吸虫核糖体DNA序列中比较保守的ITS-2区域，利用软件Primer5设计1对普通PCR扩增引物，FasITS2U：5’-ATAAACTATCACGACGCC CAAA-3’和FasITS2L：5’-AGCATCAGACACATGA CCAAG-3’，预期扩增片段长度为322 bp，用于构建重组克隆质粒，同时利用软件Beacon Designer7.0设计1对荧光PCR引物和探针，FasITS-F：5’-ACCCTTGTCTTGGCAGAAAGC-3’，FasITS-R：5’-CAAACACACTGACAACTGAGTAC-C-3’，FasITSQ：5’-FAM-ACCCGATTATTAAACCACGATTCCGC CACT-ECLIPSE-3’，预期扩增片段长度为89 bp。引物合成后（Invitrogen），均稀释为10 μmol/L，-20℃保存备用。

2.2.1.3 基因克隆及阳性质粒的构建

以肝片吸虫虫体基因组DNA为模板，采用引物FasITS2U和FasITS2L进行PCR，扩增完毕，取PCR产物电泳并切胶回收（OMEGA，D2500-01）目的条带克隆到pMD18-T载体（TaKaRa，D6011），转化大肠杆菌JM109感受态细胞（TaKaRa，D9052），经蓝白斑筛选、PCR鉴定获得含目的基因片段的重组质粒，纯化（OMEGA，D6943-01）后测浓度，-20℃保存备用。

2.2.2 肝片吸虫实时荧光PCR检测方法的建立

2.2.2.1 肝片吸虫实时荧光PCR检测方法的反应体系与反应条件

以肝片吸虫阳性克隆质粒DNA为模板，建立肝片吸虫荧光PCR检测方法，反应体系组成为（25 μL）：DNA模板1 μL，FasITS-F 1 μL，FasITS-R 1 μL，FasITS-Q 1 μL，2×preMix 12.5 μL，灭菌ddH2O补充至25 μL。

荧光PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，57℃退火30 s，扩增40个循环，每个循环的第二步反应结束时检测荧光。

2.2.2.2 肝片吸虫实时荧光PCR检测方法敏感性确定

用Dilution Buffer（TaKaRa，9160）依次将质粒DNA进行10倍梯度稀释至1.0×106、105、104、103、102、101、100拷贝/μL，检测所建立肝片吸虫荧光PCR方法的敏感性。

2.2.2.3 肝片吸虫实时荧光PCR检测方法特异性的检测

以肝片吸虫虫体基因组DNA为阳性对照，分别以华支睾吸虫DNA、姜片吸虫DNA、卫氏并殖吸虫DNA作对照，同时以灭菌蒸馏水作为阴性对照，检测所建立肝片吸虫荧光PCR方法的特异性。

2.2.3 肝片吸虫虫卵的实时荧光PCR检测

新鲜肝片吸虫成虫用生理盐水冲洗后置于酒精中固定，待虫体变直后，取出剪开卵巢，收集肝片吸虫虫卵，采用文献[5]中介绍的方法分离单卵囊，然后分别取1、2、3、4、5个卵囊，经95℃煮沸10 min处理后，以肝片吸虫荧光PCR方法进行检测，同时设蒸馏水作为阴性对照、阳性质粒DNA作为阳性对照。

3 结果

3.1 阳性克隆的构建及测序结果

以虫体DNA为模板，以引物FasITS2U和FasITS2L进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见322 bp的目的条带（图1）。切胶回收目的条带，插入到载体pMD18-T中构建成重组质粒，阳性克隆质粒送北京华大基因研究中心有限公司测序，结果经在线Blast分析，与肝片吸虫（Fasciola hapetita和Fasciola gigantic）相关基因的序列一致性达100%。提取质粒，用核酸蛋白测定仪（NanoDrop ND-100）测定浓度，计算拷贝数为1.0×1010拷贝/μL，-20℃保存备用。

图1 肝片吸虫PCR产物电泳检测结果

3.2 肝片吸虫荧光PCR检测标准曲线的绘制及敏感性和特异性试验

以临界循环数（Threshold cycle，Ct）为y轴，对应的质粒DNA标准品拷贝数的对数为x轴，制作标准曲线（图2），得到的标准曲线扩增效率为112.2%，斜率为-3.060，反应的相关系数为0.995，基本符合理论要求。由敏感性试验（图3）可知，荧光定量PCR反应检测的灵敏度为1拷贝的质粒DNA，其对应的Ct值为37.82，且扩增曲线为典型的S型曲线。特异性试验表明，本研究所建立的肝片吸虫荧光PCR检测方法与试验采用的其他寄生虫基因组DNA无交叉反应（图4），表明所设计的引物及TaqMan探针能够满足肝片吸虫特异性检测的需要。

E=112.2%；R2=0.995；slope=-3.060图2肝片吸虫荧光PCR检测方法标准曲线

图3 荧光PCR检测肝片吸虫质粒模板DNA的标准曲线

图4 肝片吸虫荧光PCR检测方法特异性试验

3.3 肝片吸虫虫卵的荧光PCR检测

以肝片吸虫荧光PCR方法检测1、2、3、4、5个卵囊，检测结果如图5所示，底限为2个卵囊。

图5 肝片吸虫虫卵的荧光PCR检测结果

4 讨论

在预防和治疗牛羊肝片吸虫时，早期诊断至关重要，此时的治疗成本低，患畜恢复快[6]。近年来，随着科学研究技术的发展，国内外学者在免疫法、血清酶诊断法、分子生物学检测法等方面进行了大量的研究与应用，使该病的诊断得到不断改进和提高。研究者一致认为酶联免疫吸附试验对诊断牛羊肝片吸虫病具有敏感性强、特异性高、操作简便的特点，是适合于早期诊断的一种检测方法[3]。但是当根据流行病学或临床症状检测发现少量虫卵时，由于肝片吸虫虫卵与姜片吸虫等其他吸虫属虫卵很难从形态上区别[7-9]，单纯从形态上来鉴定，常常容易造成误诊，因此需借助分子生物学手段来判定[10-11]。此外，分子生物学方法还可用于牛羊肉等加工制品肝片吸虫携带情况的调查与监测。

5 结论

本研究选择肝片吸虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计引物和TaqMan探针，建立了肝片吸虫实时荧光定量PCR检测方法。方法检测敏感性高，最低检测限可达到1拷贝质粒DNA，而且特异性良好，与华支睾吸虫、姜片吸虫、卫氏并殖吸虫无交叉反应；检测虫卵可以检测到2个肝片吸虫卵囊。本方法以其快速、灵敏和特异的优点，适用于牛羊肝脏等动物产品中肝片吸虫的检疫以及牛羊养殖场肝片吸虫病的流行病学调查和监测。

[1]徐怀英，朱瑞良，赵宏坤.肝片吸虫病诊断与防治研究进展[J].中国兽医寄生虫病，2000，8（4）：49-51.

[2]李晓娟.肝片吸虫重组GST、CatL蛋白及其DNA核酸联合免疫初步研究[D].大庆：黑龙江八一农垦大学，2009年：1-4.

[3]何博.牛、羊肝片吸虫病诊断方法概述[J].畜牧业，2010，（2）：74-76.

[4]周晓丽，朱国坡，李雪华，等.实时荧光定量PCR技术原理与应用[J].中国畜牧兽医，2010，37（2）：87-89.

[5]龚振兴，刘毅，刘增再，等.鸡球虫单卵囊分离技术与雏鸡感染试验[J].动物医学进展，2006，27（3）：72-75.

[6]高海英.牛羊肝片吸虫病及其防控[J].畜牧与饲料科学，2015，36（10）：125-126.

[7]许世锷，陆秀君，李绪琼，等.肝片形吸虫、布氏姜片吸虫和日本血吸虫毛蚴体表结构的比较观察[J].汕头大学学报，1988，3（2）：47-52.

[8]刘立恒，郭海宁，吴家斌.肝片吸虫生活史各阶段形态变化观察[J].黑龙江畜牧兽医，2013，（24）：33-34.

[9]许鹏如.布氏姜片吸虫Fasciolopsis buski（Lankester，1857）Odhner，1902生活史的研究[J].畜牧兽医学报，1962，5（2）：143-162.

[10]Le T H，Nguyen K T，Doan H T，et al.Development and Evaluation of a Single-Step Duplex PCR for Simultaneous Detection of Fasciola hepatica and Fasciola gigantic（Family Fasciolidae，Class Trematoda，Phylum Platyhelminthes）[J].J Clin Microbiol，2012，50（8）：2720-2726.

[11]Alasaad S，Soriguer R C，Abu-Madi M，et al.A TaqMan realtime PCR-based assay for the identification of Fasciola spp[J].Vet Parasitol，2011，179（1-3）：266-271.

Establishment of Real Time PCR Method for Detection of Fasciolosis in Bovine and Sheep

WANG Caixia1，LIN Xiangmei1，WU Shaoqiang1*，XU Geng2
（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100029；2.Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Yinan City of Shandong Province）

To facilitate rapid and sensitive diagnosis of Fasciolosis，the real time TaqMan PCR method was developed to detect Fasciolosis infection in bovine and sheep.The primers and Taqman probe were designed and chosen to amplify the conserved internal transcript spacer 2（ITS-2）segment of genus Fasciolosis ribosomal DNA.The sensitivity and specificity of the developed method were examined using the plasmid containing the targeted ITS-2 fragment as template.The primers and probe were specific enough to distinguish Fasciolosis from clonorchis sinensis，fasciolopsis and paragonimus westermani.The dynamic range of the developed method was between 1×100and 1×106copies，meaning that the target DNA could be reliably detected and quantified for plasmid template DNA at a concentration as low as one copy.Two fasciola oocysts could be detected by this real time PCR method.In conclusion，the real time PCR method is rapid，sensitive and specific for Fasciolosis，and can be used to inspect Fasciolosis in the farm and for quarantine use.

Fasciolosis；Real-time PCR；Sensitivity；Specificity；Detection

Q789

E-mail：friday128@sina.com；*通信作者E-mail：sqwu@sina.com

“十二五”国家科技支撑计划课题（2012BAK11B04）、（2013BAD12B01）

2016-10-20