经皮芒硝超声导入对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺及相关性腹水的影响

杨伟刚 王志兵 金佳佳 陆周翔 陈建华

·论著·

经皮芒硝超声导入对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺及相关性腹水的影响

杨伟刚 王志兵 金佳佳 陆周翔 陈建华

目的观察经皮芒硝超声导入对急性胰腺炎（SAP）模型大鼠胰腺及相关性腹水（PAAF）的影响。方法将60只雄性SD大鼠随机分为SAP对照组、芒硝外敷组、超声导入组，每组20只。采用胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠的方法制备重症急性胰腺炎（SAP）模型。72h后处死，检测各组大鼠腹水量、血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、腹水淀粉酶（AMY）变化，对胰腺组织进行病理学检查。结果芒硝外敷组及超声导入组腹水量、血清TNF-α、腹水AMY等均显著低于SAP对照组[腹水量：（11.7±1.0）g、（7.9±1.5）g比（16.3±2.4）g，P＜0.05或P＜0.01；TNF-α：（93.38±11.27）ng/L、（56.15± 17.30）ng/L比（120.46±20.16）ng/L，P＜0.05或P＜0.01；AMY:（13 296.0±428.2）U/L、（7236.0±578.6）U/L比（17 548.0±537.6）U/L，P＜0.05或P＜0.01]，芒硝外敷组及超声导入组病理评分均显著低于对照组[（7.6±0.6）分、（5.2±1.2）分比（9.8±0.5）分，P＜0.05或P＜0.01]，提示芒硝外敷组及超声导入组较对照组胰腺组织炎症、水肿、出血、坏死程度减轻，其中超声导入组改善更优于芒硝外敷组（P＜0.05）。结论芒硝外敷能改善SAP模型大鼠的炎症和PAAF，经皮芒硝超声导入法疗效优于传统芒硝外敷。关键词大鼠；急性胰腺炎；腹水；动物模型；芒硝；超声导入；TNF-α

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）时可产生大量胰腺炎相关性腹水（pancreatitis associated ascitic fluid，PAAF），腹水中含有大量的胰酶、炎症介质、内毒素等有害成分，能促进病情的发展，是影响SAP预后的重要因素[1]。因此，减少和控制PAAF对缓解病情的发展有积极的治疗作用。临床常用芒硝外敷治疗胰腺水肿和腹腔渗液，研究[2]证实，芒硝外敷有消炎止痛，预防感染，吸收腹腔渗液，促进脓肿吸收等功效。近年研究[3]证实，采用超声透皮给药，可以增强包括大分子药物在内的许多药物的透皮传输。本研究旨在利用经皮芒硝超声导入法，观察芒硝对PAAF及炎症的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠60只，体质量180～220g，浙江中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：X1402263。饲养温度20～23℃，环境湿度50%。

1.2 药品与试剂芒硝，由湖州市中医院中药房提供。牛磺胆酸钠（美国Sigma公司），TNF-αELISA试剂盒（购自武汉优尔生商贸有限公司，批号L130813345）。

1.3 仪器高速离心机（上海精密器材厂）；酶标仪（美国SUNRISE公司）；迈瑞BS-300全自动生化分析仪（深圳迈瑞公司）；超声中频导药仪（沈阳市美辰医疗器械有限公司，型号MCTD-01型）。

2 实验方法

2.1 分组与造模按随机数字表法将60只大鼠随机分成对照组、外敷组（传统芒硝外敷）和超声导入组（经皮芒硝超声导入），各20只。全部大鼠禁食不禁水12h，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,取上腹部正中切口进腹后顺胃逐步找到开口于十二指肠起始部的胰胆管，用针头自开口根部逆行缓慢注射5%牛磺胆酸钠（0.10mL/100g）采用微量泵恒速注入，注射结束用微血管夹钳闭胰胆管，15min后取出微血管夹关腹。

2.2 给药方法造模后，各组按20mL/（kg·d）皮下注射平衡液以支持，各组大鼠均以纱布袋敷于大鼠腹部,用束带在大鼠背部捆绑,并在芒硝袋四角用丝线固定于大鼠腹部皮肤上各1针，外敷组、超声导入组袋中装有30g芒硝，对照组袋中装有同样重量铝片；超声导入组大鼠不间断超声导入芒硝，每12h更换芒硝1次。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 腹水量和腹水淀粉酶（amylase，AMY）检测72h后全部大鼠予以处死，于腹部行“U”型剖腹切口，开腹后用已称重的灭菌干棉球吸尽腹腔腹水，再次称重，两次重量差即为腹水量；腹水称重后送本院检验科由迈瑞BS-300全自动生化分析仪测定腹水AMY。

2.3.2 血清TNF-α检测于腹主动脉取血3mL，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定，按试剂盒说明书进行操作。

2.3.3 胰腺病理学检测及评分取大鼠完整胰腺组织，以4℃0.9%氯化钠洗净胰腺组织，观察大鼠胰腺大体变化。沿主胰管轴剖开胰腺，切取胰腺标本放入10%甲醛固定液中，制成石蜡切片，HE染色，盲法对大鼠胰腺组织切片行病理学检查，按Schmidt等[4]标准进行评分，根据胰腺炎改变的主要特点，水肿、坏死、出血、炎性细胞浸润等四项评分相加为每张切片的病理评分结果，评分越高，胰腺组织病理改变越严重。

2.4 统计学方法应用SPSS19.0软件进行统计分析。计量数据以（x±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组SAP大鼠腹水量比较各组大鼠腹腔内均可见重量不等的腹水，SAP对照组可见血性腹水。与SAP对照组比较，芒硝外敷组及超声导入组腹水量明显减少（P＜0.05，P＜0.01），超声导入组大鼠腹水量低于芒硝外敷组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组重症急性胰腺炎模型大鼠腹水量比较（g，x±s）

3.2 各组SAP大鼠血清TNF-α和腹水AMY比较与SAP对照组比较，芒硝外敷组及超声导入组大鼠血清TNF-α和腹水AMY水平均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；超声导入组大鼠血清TNF-α和腹水AMY均低于芒硝外敷组（P＜0.05）。见表2。

3.3 各组SAP大鼠胰腺组织病理观察SAP对照组胰腺小叶及腺泡高度水肿，腺泡小叶结构片状坏死，胰腺组织可见明显出血。芒硝外敷组和超声导入

表2 各组重症急性胰腺炎模型大鼠血清TNF-α和腹水AMY比较（x±s）

S组胰腺小叶及腺泡水肿较轻，腺泡小叶结构坏死面积减少，炎性细胞浸润程度也显著减轻。超声导入组与芒硝外敷组相比，效果更显著。见图1（封二）。

3.4 各组SAP大鼠胰腺组织病理评分比较与SAP对照组比较，芒硝外敷组及超声导入组大鼠胰腺组织病理评分均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；超声导入组病理评分明显低于芒硝外敷组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组SAP大鼠胰腺组织病理学评分比较（分，x±s）

4 讨论

SAP时由于胰管压力增高，炎症介质的“级联瀑布效应”致使PAAF迅速出现,PAAF中含有大量的胰酶、炎症介质和内毒素等有害成分经腹膜吸收进入体循环，是导致SIRS和MODS的重要原因[5]。因此，早期干预和控制PAAF对缓解病情的发展有重要意义。近年来，临床上常采用腹腔灌洗、手术引流及B超引导下穿刺引流等方法减少腹水及毒性物质的吸收已取得良好的疗效，但均为有创操作，增加了感染、胰瘘等风险。临床上，芒硝外敷常被广泛用于治疗腹腔积液，作为中医“内病外治法”对急性胰腺炎也有很好辅助治疗效果。

中医认为，芒硝苦能泻热，咸能软坚，其性善消,为“热淫于内,治以咸寒”的代表药,具有内服泄热通便、软坚散结,外用消炎、渗湿之功[6]。芒硝为含水硫酸钠的天然矿物经精制而成的结晶体，外敷能吸附腹部水分及炎性递质，使腹腔渗液吸收加快，防止腹膜炎，促进肠蠕动，防治肠麻痹，减少胰腺继发感染的作用[7]。然而传统的外敷给药方式，由于皮肤角质层的屏障作用，对于药物的吸收效率较低，影响治疗效果。临床上已采用超声药物导入法来提高外用药物的渗透作用，主要机制是利用超声的空化作用，通过改变角质层角化细胞排列结构来提高皮肤渗透能力[8]。本研究中芒硝外敷组腹水量明显少于SAP对照组，证实芒硝对腹水的缓解作用，同时超声导入组腹水量低于芒硝外敷组，且差异有统计学意义（P＜0.05），胰腺组织病理评分更低，说明超声导入法疗效优于单纯芒硝外敷。

在急性胰腺炎病情进展中，腹水中胰酶和炎症介质发挥着重要作用。研究[9-11]表明，PAAF能激发细胞产生TNF-α,可以升高至血清浓度的3～16倍。大量释放的TNF-α可直接导致胰腺腺泡细胞坏死，同时也是SIRS的始动因子，刺激其他炎症介质如IL-1、IL-6等的释放，对胰腺造成“二次打击”。因此，血清TNF-α水平可反应胰腺组织的炎症损害程度。胰酶是发生SAP最直接的因素，不仅可以破坏胰腺自身组织,还可渗出至胰腺周围和腹腔损伤腹腔内脏器，尤其可以使脂肪组织坏死液化。所以，相比血清AMY，采用腹水AMY水平更能反映胰腺的炎症程度。本实验中SAP对照组血清TNF-α和腹水AMY水平均明显高于外敷及超声导入组，其相应的胰腺组织病理评分也明显高于另两组，也证实了上述观点；同时通过比较发现超声导入组血清TNF-α和腹水AMY水平低于芒硝外敷组，前者病理评分更低（P＜0.05），可见芒硝超声导入疗效优于传统外敷组。

综上所述，运用中医“内病外治”理论结合现代超声给药方式，经皮芒硝超声导入法，对大鼠SAP模型及PAAF的疗效优于传统芒硝外敷，安全有效，方法简便，为临床应用提供依据。

［1］Elieen M.Human papillomavirus and cervical cancer［J］.Clin Micro-biol Res，2003，16（1）：17.

［2］薛志祥，葛茂军，龚航军.芒硝外敷用于外科急腹症的疗效观察[J].上海中医药大学学报，2000，14（2）：23.

［3］Mitragotri S，Kost J.Low-frequency sonophoresis a review［J］.Advaneed Drug Delivery Reviews，2004，56（5）：589-601.

［4］Schmidt J，Lewandrowsi K，Warshaw AL，et al.Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat［J］.Int J Pancreatol，1992，12（1）：41-51.

［5］施煜燕，周建波，钟静红.C反应蛋白和腹腔积液在急性胰腺炎早期预后评估中的价值［J］.中华胰腺病杂志，2015，15（1）：49-51.

［6］魏荣锐，曹珊，杨亚蕾，等.外用芒硝对大鼠外伤性血瘀模型的影响［J］.中华中医药杂志，2011，26（8）：1719-1722.

［7］马德花，马海军.芒硝外敷联合清胰汤内服治疗重症急性胰腺炎并发肠麻痹疗效观察［J］．中国实用医药，2012，7（11）：174．

［8］屠熙，尹芹芹，张文胜，等.低频超声透皮给药的研究进展与应用［J］.生物医学工程学杂志，2008，25（6）：1474-1478.

［9］肖彦，王湘英.重症急性胰腺炎与炎性细胞因子［J］.医学临床研究，2008，25（4）：703-705.

［10］Ramudo L，Manso MA，De Dios I.Biliary pancreatitis—associated ascitic fluid activates the production of tumor necrosis in aeinar cells［J］.Crit Care Med，2005，33（1）：143-248.

［11］Malleo G，Mazzon E，Siriwardena AK，et al.TNF-alpha as a therapeutic target in acute pancreatitis-lessons from experimental models［J］.Scientific World Journal，2007，7（1）：431-448．

（收稿：2016-12-16修回：2017-01-10）

Influence of Phonophoresis of Mirabilite on Pancreatitis Associated Ascitic Fluid in Rats

YANG Weigang, WANG Zhibing,JIN Jiajia,LU Zhouxiang,CHEN Jianhua.
Department of General Surgery,Huzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Huzhou(313000),China

ObjectiveTo investigate the influence of sonophoresis of mirabilite on pancreatitis associated ascitic fluid（PAAF）in rats.MethodsSixty male SD rats were randomly divided into control group,mirabilite-external application group and mirabilite-phonophonesis group（20 rats in each group）.The rat model of severe acute pancreatitis（SAP）was established by injecting 5%sodium taurocholate retrogradely into the biliary-pancreatic duct. The rats were killed after 72-h treatment.The volume of ascetic fluid,the level of serum TNF-α and ascites amylase（AMY）were detected,the pathological examination of pancreatic tissue samples was performed.Results The ascitic amount,serum TNF-α and ascitic AMY in mirabilite-external application group and mirabilite-phonophonesis group were significantly lower than those in control group（ascitic amount:11.7±1.0g and 7.9±1.5g vs 16.3±2.4g;TNF-α:93.38±11.27ng/L and 56.15±17.30ng/L vs 120.46±20.16ng/L;AMY:13296.0±428.2U/L and 7236.0±578.6U/L vs 17548.0±537.6U/L;all P＜0.05 or P＜0.01）.The pathological score in mirabilite-external application group and mirabilite-phonophonesis group were significantly lower than that in control group（7.6±0.6 and 5.2±1.2 vs 9.8±0.5,P＜0.05 or P＜0.01）.The pathological examination results showed milder inflammation of pancreatic tissue,edema,hemorrhage,and necrosis in both mirabilite groups compared with that in control group,pathological injury seemed obviously decreased in phonophonesis group.ConclusionPhonophoresis of mirabilite can improve the therapeutic effect of mirabilite for PAAF and more effectively alleviate inflammation of pancreas than a simpler method,indicating this method has preciser curative effect on SAP in rats.

rats;acute pancreatitis;ascetic fluid;animal model;mirabilite;phonophoresis;TNF-α

浙江省中医药科技计划项目（No.2013ZB125）

浙江省湖州市中医院普外科（湖州313000）

陈建华，Tel：13757288951；E-mail：865012567@qq.com