草莓果腐败霉菌的分离、鉴定及其防腐方法探索

杨茜然，顾晓颖，张云娟，汪雯，李凌飞

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明650201）

草莓果腐败霉菌的分离、鉴定及其防腐方法探索

杨茜然，顾晓颖，张云娟，汪雯，李凌飞*

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明650201）

目的：对草莓果上的腐败霉菌进行分离鉴定，并探索其防腐方法，为草莓的保鲜、贮藏及深加工过程中有目的地控制霉菌提供合理有效的依据。方法：采用传统平板法分离草莓果上的霉菌，通过形态学观察结合DNA序列分析方法对所分离的菌株进行鉴定。结果：引起草莓果腐败的霉菌主要是普通青霉（Penicillium commune）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、奥尔森青霉（Penicillium olsonii）、小刺青霉（Penicillium spinulosum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、深绿木霉（Trichoderma atroviride）、尖小丛壳菌（Glomerella acutata）及拟盘多毛孢（Pestalotiopsis sp.）。同时，采用紫外杀菌、山梨酸溶液、植酸溶液处理结合低温冷藏技术对草莓果上的微生物进行抑制，结果表明使用0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低温冷藏抑菌效果最好。结论：引起草莓果腐败变质的霉菌主要包括5个属9个种，其中青霉属是引起草莓果腐败变质的优势菌群。通过比较几种保鲜方法，表明0.05%的山梨酸溶液处理是一种较为理想的草莓果贮藏保鲜方法。

草莓；霉菌；鉴定；抑制

草莓（Fragaia ananassa Duch.）是蔷薇科草莓属的多年生草本植物。果实色泽鲜艳，果肉柔软多汁，酸甜可口，老少皆宜，深受消费者喜爱。草莓富含维生素，有机酸以及矿质元素，具有很高的营养价值和食疗作用〔1〕，享有“水果皇后”之美誉。草莓果实为浆果，果皮极薄，组织娇嫩，在采摘后的贮藏运输过程中极易受到机械损伤；并且草莓含水多，含糖量高，是多种微生物的天然培养基。因此草莓在储运过程中，极易受到微生物污染，不仅导致草莓快速腐败变质，也带来了食用安全问题。目前，国内外对草莓微生物的研究主要集中在草莓栽培过程中一些微生物病害〔2-3〕，关于草莓采后果实上微生物种群组成的研究较少。潘见等〔4〕对采摘后的草莓进行卫生微生物检查，从中分离到了8科10属16种细菌。李枝文〔5〕从草莓发酵液中分离到了2株酵母菌。然而，目前对草莓采后腐败变质的霉菌研究甚少。本研究在传统微生物分离纯化的基础上，应用形态学方法结合现代分子生物学技术对草莓果上的霉菌进行分类鉴定，同时探讨草莓果上腐败霉菌的抑制方法，从而为草莓的保鲜、贮藏及深加工过程中有目的地控制微生物提供合理有效的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料草莓果分别采自昆明市西山区和玉溪市红塔区草莓种植基地，随机抽样进行检测。

1.2 霉菌的分离霉菌的分离采用两种方法：一是按照国标GB 4789.15-2010方法，用孟加拉红培养基于28℃培养72 h分离草莓果上的霉菌。二是将采来的新鲜草莓果放至自然腐败变质，从已发霉的草莓果上直接挑取霉菌菌丝进行分离纯化。所分离的霉菌用马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基）进行纯化后，挑取单菌落进行保存。

1.3 霉菌的分类鉴定

1.3.1 霉菌的形态学观察根据常用的霉菌鉴定方法，通过观察霉菌的形态特征，对照《真菌分类学》〔6〕对霉菌进行初步鉴定。

1.3.2总DNA的提取根据形态学初步鉴定的结果，选择代表菌株，利用CTAB法（石英砂研磨）〔7〕提取真菌基因组DNA。

1.3.3 PCR条件通过真菌通用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对ITS（包括5.8S）区进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：2×Premix Taq（TaKaRa）25μL，DNA模板2μL，引物（10μmol∕L）各2μL，去离子水补足至50μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，进行30个循环，72℃后延伸10 min。

1.3.4 DNA序列分析PCR扩增产物经纯化后送至上海生物工程有限公司进行DNA测序。所获得的DNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析。根据比对结果，选取同源性较高的已知菌株的ITS序列和所测菌株的序列一起构建系统发育树。采用Mega 4.0软件中邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树。

1.4 草莓果防腐方法探索将采来的新鲜草莓果采用紫外杀菌、山梨酸溶液、植酸溶液处理后分别在室温和4℃低温条件下储存，每种处理做3个平行，每一平行的样本数为20颗草莓。每天定时观察草莓的腐败变质情况，记录每一处理中变质草莓果的颗粒数以及外观变化，利用腐烂率来衡量抑制效果（腐烂率：用累积法统计，以腐烂颗数占果实总数的百分比表示）。见表1。

表1 草莓果的防腐方法

1.5 数据统计分析采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。对于各处理方法的防腐效果比较，两两比较采用配对样本t检验、三组及三组以上数据比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 霉菌的形态学特征及其鉴定结果经分离纯化，得到9种霉菌单菌落，其形态特征及鉴定结果如下：CF8菌株：在PDA培养基上，菌落局限生长，具几道同心环或无同心环，无渗出液。产生较多小分生孢子，分生孢子面灰绿色，呈球形或近球形，链状排列，孢壁平滑；分生孢子梗壁光滑，帚状枝双轮生，叉开。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为普通青霉（Penicillium commune）。

CF14菌株：在PDA培养基上，菌落局限生长，有大量放射状皱纹；菌丝体白至微黄色，有大量黄色渗出液；菌落反面呈黄褐色，产生大量淡黄色可溶性色素。产生大量小分生孢子，分生孢子面蓝绿色，呈椭圆形或近球形，链状排列，孢壁光滑；分生孢子梗壁光滑，帚状枝三轮生，少量为两轮生，稍叉开；结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为产黄青霉（Penicillium chrysogenum）。

CF9菌株：在PDA培养基上，菌落具有放射状皱纹，质地绒状，无渗出液。菌落反面灰绿色，无可溶性色素。产生大量小分生孢子，灰绿色，呈椭圆形，链状排列，孢壁光滑；分生孢子梗壁平滑；帚状枝通常三轮生，梗基紧贴。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为奥尔森青霉（Penicillium olsonii）。

TF18菌株：在PDA培养基上，菌落局限生长，具有放射状皱纹；菌丝体白色，无渗出液；菌落反面呈淡黄色，无可溶性色素。产生大量小分生孢子，分生孢子面蓝绿色，呈球形或近球形，链状排列，孢壁上具有明显的刺状突起；分生孢子梗壁平滑，帚状枝单轮生，偶有双轮生。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为小刺青霉（Penicillium spinulosum）。

TF16菌株：在PDA培养基上，菌落有放射状的沟纹；菌落中央呈土褐色，边缘白色，无渗出液；菌落反面呈棕褐色。产生大量小分生孢子，呈球形或近球形，孢壁光滑；分生孢子囊直柱形，顶囊半球形；小梗双层，排列紧密，布满顶囊表面的2∕3。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为土曲霉（Aspergillus terreus）。

CF12菌株：在PDA培养基上，菌落生长迅速，有少量同心轮纹；菌落开始为白色，2～3 d后转为灰绿色，无渗出液；菌落反面呈浅绿色。产生大量小分生孢子，呈球形，链状排列，孢壁上有粗糙突起；分生孢子头圆柱状，顶囊绿色，烧瓶状；小梗单层，布满顶囊表面的3∕4。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。

CF10菌株：在PDA培养基上，菌落生长迅速，初期为白色绒状，后期转为绿色至深绿色。产生小分生孢子，多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端，表面有刺突；分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，在分枝末端形成瓶状小梗。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为深绿木霉（Trichoderma atroviride）。

CF19菌株：在PDA培养基上，菌丝初期呈白色，后期颜色加深，变为红灰色，有同心轮纹。小分生孢子盘黑色、圆形或近圆形，较稀疏，分生孢子梭状、单孢；刚毛密集，有分隔，基部膨大；分生孢子梗分枝。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为尖小丛壳菌（Glomerella acutata）。

TF5菌株：在PDA培养基上，菌落初期为白色，后期变为淡褐色，具有轮状条纹；菌落背面呈土黄色。产生大分生孢子，呈纺锤形，直或略弯曲，由5个细胞构成，中间3个细胞褐色，并且3个细胞不同色，两端细胞无色；顶部细胞圆锥形，有2根顶端附属丝；具有分生孢子盘。结合形态学特征及系统发育分析，将其鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）。见图1。

2.2 草莓果防腐方法探索结果分别在室温和4℃低温贮存条件下，采用紫外杀菌、山梨酸溶液、植酸溶液对草莓果上的霉菌进行抑制，测定草莓果的保鲜效果。见表2。

表2 不同防腐处理后草莓的腐烂率（%）

图1 草莓果霉菌的ITS序列系统发育树

研究结果表明，4℃低温贮存保鲜效果明显优于常温条件（P＜0.05）。通过比较不同防腐处理方法，可以看出，4℃低温贮藏保鲜条件下，山梨酸溶液处理后草莓腐烂率显著低于紫外照射和植酸溶液处理（P＜0.05）；且0.05%、0.10%和0.15%的山梨酸钾溶液处理效果差异无统计学意义。故从成本及限量标准考虑，0.05%的山梨酸溶液处理是一种较为理想的草莓贮藏保鲜方法。

3 讨论

草莓果极不耐贮运，常温下存放1～2 d就会变色变味，开始腐烂变质〔8-9〕。因此，对草莓果上的微生物进行检查与鉴定，并有针对性地研究适宜的草莓贮藏保鲜技术显得尤为重要。草莓果上的微生物十分丰富，其微生物区系包括细菌、霉菌和酵母。潘见等〔4〕采用VITEK微生物自动鉴定系统对从草莓上分离到的细菌进行了鉴定，结果表明草莓细菌有8科10属16种。目前对莓果上的霉菌研究较少，而实际上，霉菌引起草莓腐败变质十分常见。李英华等〔10〕从新疆腐烂的草莓中分离到了4种真菌，分别是黑根霉、青霉属、灰葡萄孢和疫霉属。魏超等〔11〕从成都产的草莓中分离到4种真菌，鉴定为灰葡萄孢、青霉属、单囊壳属和曲霉属。本研究从草莓果上分离鉴定了9种霉菌，包括青霉属4种（普通青霉、产黄青霉、奥尔森青霉、小刺青霉）、曲霉属2种（土曲霉和烟曲霉）、深绿木霉、尖小丛壳菌及拟盘多毛孢。由此可见，不同产地草莓果上的霉菌种类具有一定差异，这可能与气候、环境、草莓品种等因素有关。但不同产地的草莓果上均分离到青霉，因此，青霉是引起草莓果腐败变质的优势霉菌。

草莓果的贮藏保鲜技术已成为当前研究的热点，国内外研究和应用较广泛的技术有低温贮藏、气调贮藏、防腐保鲜、涂膜保鲜等〔12-13〕。依据安全无毒、经济可行、易于推广的原则，本研究分别采用紫外杀菌、山梨酸溶液、植酸溶液处理结合低温冷藏技术对草莓果的防腐效果进行探索。结果表明使用0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低温冷藏抑菌效果最好。Allais等〔14〕的研究结果表明，近冰点温度（例如2℃）贮藏采后的草莓，能显著降低果实的生理代谢活动，从而极大地抑制微生物生长繁殖，延长草莓的保鲜期。

山梨酸是一种国际公认安全的防腐剂，联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）、美国食品药品监督管理局（FDA）都对其安全性给予了肯定，其毒性仅为苯甲酸的1∕4、食盐的1∕2，且对人体不会产生致癌和致畸作用〔15〕。山梨酸具有很好的抗菌性，能有效抑制霉菌、酵母菌及其他好氧菌，已广泛应用于食品、饮料、医药、化妆品、农产品等行业。对于经表面处理的鲜水果、鲜蔬菜、酱渍的蔬菜、盐渍的蔬菜、加工食用菌及藻类，中国制定的山梨酸的限量标准为0.5 g∕kg（即0.05%），而国际食品法典委员会（CAC）、FDA和日本则规定为1.0 g∕kg（即0.1%）。在本研究中，草莓果经0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低温冷藏，可保鲜6 d，具有较好的抑菌效果。本研究为草莓果的保鲜、贮藏及深加工过程中有目的地控制霉菌提供合理有效的依据。

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Isolation,Identification and Methods for Inhibiting Growth ofthe Spoilage Molds from Postharvest Strawberry Fruits

Yang Qianran,Gu Xiaoying,Zhang Yunjuan,Wang Wen,Li Lingfei*
（College ofFood Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China）

Objective:The molds from spoilage strawberries were isolated and identified,and the methods for preventing rot were explored to provide a reasonable and effective basis for controlling the molds purposively during the processes ofkeeping fresh,storage and deep processing for strawberries.Methods:The molds isolated from strawberry fruits were identified by morphological characteristics and DNA sequence analysis.Results:The molds causing strawberry rot included Penicillium commune,Penicillium chrysogenum,Penicillium olsonii,Penicillium spinulosum,Aspergillus terreus,Aspergillus fumigates,Trichoderma atroviride,Glomerella acutata and Pestalotiopsis sp..Furthermore,the molds from strawberry fruits were inhibited respectively using ultraviolet,sorbic acid, phytic acid sterilization combining cold storage.It was showed that cold storage after 0.05%sorbic acid was the best preservative method for strawberry fruits.Conclusion:The molds causing strawberry rot were classified 5 genera and 9 species,among which Penicillium was the dominant genus causing strawberry rot.The present results showed that 0.05%sorbic acid solution was an ideal method forfresh keeping and storage ofstrawberries.

strawberry;molds;identification;inhibition

R154

A

2096-2266（2017）06-0059-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.014

（责任编辑李杨）

云南省中青年学术技术带头人后备人才资助项目（2011HB027）；云南省自然科学基金资助项目（2016FB030）

2017-01-04

2017-02-09

杨茜然，硕士研究生，主要从事食品微生物研究.

*通信作者：李凌飞，副教授，博士.