基于指纹图谱和化学计量学的多基原秦艽药材化学品质比较研究
2017-07-03张晓灿李杨罗丹丹陶爱恩段宝忠
张晓灿,李杨,罗丹丹,陶爱恩,段宝忠
(大理大学药学与化学学院,云南大理671000)
基于指纹图谱和化学计量学的多基原秦艽药材化学品质比较研究
张晓灿,李杨,罗丹丹,陶爱恩,段宝忠*
(大理大学药学与化学学院,云南大理671000)
目的:比较秦艽药材3种基原药材秦艽、小秦艽和粗茎秦艽的化学品质差异,为多基原秦艽药材品质评价提供参考。方法:采用高效液相色谱法,建立3种药材的HPLC指纹图谱,结合化学计量学方法对其品质进行比较。结果:3种药材的化学指纹图谱种间相似度有一定差异,与秦艽药材共有模式图谱相比,秦艽种内相似度均大于0.990;小秦艽与其种间相似度为0.864和0.823;粗茎秦艽在0.643~0.912之间。聚类分析和主成分分析将17批秦艽药材分成秦艽、小秦艽和粗茎秦艽3类。结论:秦艽、小秦艽、粗茎秦艽3种药材化学成分存在一定差异,但主要成分峰形特征相似;化学计量学方法可用于不同品种秦艽的基原识别。
多基原;秦艽;指纹图谱;化学计量学;品质差异
中药是多种化学成分组成的复杂的集合体,对于中药的质量控制一直是一个难点,多基原药材使得中药质量控制更加复杂化〔1〕。秦艽是重要的传统常用中药〔2〕,为典型的多基原药材,其法定来源有龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽G.straminea Maxim.、粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽G.dahurica Fisch.4种基原的干燥根〔3〕。由于中药的药效取决于其所含的化学物质,多基原药材间的化学成分可能有差别或完全不同,从而导致药理作用和临床疗效也不尽一致〔4〕。近年来,众多学者对秦艽类药材的药材品质和指纹图谱进行了大量的研究〔5-8〕,但未见对药典秦艽药材不同基原的指纹图谱进行比较的相关研究。鉴于此,本研究采用高效液相色谱法,建立了秦艽药典3种基原药材秦艽、粗茎秦艽和小秦艽HPLC指纹图谱,利用中药色谱指纹图谱和化学计量学方法,分析比较了秦艽3种基原药材的质量差异,以期为多基原秦艽药材的质量标准制定提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂Agilent 1200高效液相色谱仪(Agilent Technologies,USA),包括:G1322A在线脱气机、G1311A四元梯度泵、G1329A进样器、G1316A柱温箱、G1314B VWD检测器和ChemStation色谱工作站。AgilentZorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司,KQ-5200DB),AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。色谱级甲醇(Fisher Scientific,Fairlawn New Jersey),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
17批秦艽、小秦艽和粗茎秦艽药材收集于2012年4月至2016年1月,药材经段宝忠副教授鉴定,标本存放于大理大学中药标本馆。见表1。
表1 样品信息表
1.2 色谱条件、供试品溶液制备按参考文献〔8〕进行。
1.3 数据分析指纹图谱数据使用中药指纹图谱相似度评价系统(2.0版)软件计算各批样品的相似度;使用SPSS 17.0软件对矩阵数据进行标准化处理后进行聚类分析;使用The Unscrambler X 10.4分析软件,进行主成分分析(PCA)。
2 结果
2.1 方法学考察精密度试验:取同一供试品溶液,按“1.2”项下色谱条件连续进样6次,记录各色谱峰峰面积,RSD<0.86%,保留时间RSD<0.32%,表明仪器精密度良好。重复性试验:取同一样品6份,按“1.2”项下方法制备,进样测定。各色谱峰峰面积RSD<0.97%,表明方法重复性良好。稳定性试验:取同一份供试品溶液,分别在0、4、8、12、18、24、48 h进行测定,各色谱峰峰面积RSD<1.27%,表明各供试品溶液在48 h内稳定。
2.2 指纹图谱相似度采用中药指纹图谱相似度评价系统(2.0版),生成10批秦艽药材共有模式色谱图,见图1。将17批药材导入软件与秦艽共有模式色谱图比较,计算相似度。结果显示,10批秦艽药材与秦艽共有模式图谱比较,相似度均大于0.990;两批小秦艽药材与秦艽共有模式图谱比较,相似度为0.864和0.823;5批粗茎秦艽药材与共有模式图谱比较,相似度在0.643~0.912之间,见表2。
图1 10批秦艽药材的HPLC指纹色谱图谱
表2 与秦艽共有模式图谱比较相似度结果
2.3 样品聚类分析(HCA)将17批样品共有色谱峰的峰面积与药材称样量相比,对单位质量药材峰面积进行量化,得17×10阶的数据矩阵,使用Ward’s方法和欧氏距离进行聚类分析,聚类结果见图2。从图2可看出,3种秦艽药材分别被单独分为3类,见图2中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,其中Ⅰ类包括10批秦艽样品,S10和S11号样品经过多次聚类后与其他8批秦艽样品聚为一类;Ⅱ类包括5批粗茎秦艽样品;Ⅲ类包括两批小秦艽样品。
图2 样品聚类分析图
2.4 样品主成分分析(PCA)对单位质量3种秦艽药材峰面积进行量化处理后,使用The Unscrambler X 10.4分析软件,对17批样品共有指纹图谱信息进行主成分分析。以第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的得分为横纵坐标,绘制得分散点图,见图3。结果显示3种秦艽药材得到了很好的归类,17批样本间内在的相互关系可进一步较好地体现出来,样品被分为3类,即秦艽类(Ⅰ类)、粗茎秦艽类(Ⅱ类)和小秦艽类(Ⅲ类)。主成分分析结果与聚类分析结果一致,结合图3可以实现3种秦艽药材的鉴别。
图3 17批样品主成分分析图
3 讨论
本研究采用HPLC指纹图谱和化学计量学方法研究了秦艽的3种基原植物药材的化学指纹特征差异。17批样品与秦艽共有模式图谱比较,10批秦艽样品相似度均大于0.990,秦艽药材种内质量均一,稳定性较好;两批小秦艽药材与秦艽比较相似度小于0.865,表明秦艽与小秦艽药材化学指纹差异较大,吴靳荣等研究发现小秦艽中各组分的含量明显低于其他种正品秦艽〔9〕,结合本研究中的相似度计算结果,表明秦艽与小秦艽化学指纹差异较大;5批粗茎秦艽样品中,与秦艽相比,S3和S7号样品的相似度分别为0.765,0.643,其余3批样品相似度在0.900~0.912之间,表明粗茎秦艽与秦艽相比指纹图谱有一定差异。聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)结果将17批样品分为了秦艽、粗茎秦艽和小秦艽3类。罗焜等对秦艽几种基原植物的ITS2序列的研究表明,几种药材的碱基存在明显差异〔10〕。本研究结果表明秦艽、小秦艽、粗茎秦艽3种药材的化学指纹存在差异。
中药材品种的多基原性由来已久,唐·《新修本草》注“蓝实有三种”;《本草拾遗》云“三棱总有三四种”;《图经本草》《证类本草》中一物数图者甚多,柴胡有五图、黄精有十图;《中华人民共和国药典》2015年版收载的中药材及饮片,多基原药材品种有153种之多。多基原中药品种的质量差异直接关系到临床用药的有效性和安全性〔11〕。上述秦艽的3种基原植物成分差异明显,必然影响其临床疗效,但目前3种秦艽药材在临床使用中剂量和用途相同,目前有关其药效的差异尚不明确,其科学性有待进一步的实验证实。采用现代学科新技术对中药多基原药材进行系统的研究,构建符合多基原药材特点的质量评价模式,对保证中药产品的安全有效、质量可控,使国际社会理解和接受中医药具有十分重要的意义。
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Species Differentiation and Quality Assessmentof Gentiana by High-performance Liquid Chromatographic Fingerprintand Chemometrics Analysis
Zhang Xiaocan,Li Yang,Luo Dandan,Tao Aien,Duan Baozhong*
(College ofPharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China)
Objective:To compare the chemical quality among three species of Gentiana.Methods:HPLC fingerprints of the three kinds of Gentiana have been established and analyzed with chemometric methods including similarity evaluation,hierarchical cluster analysis and principalcomponentanalysis.Results:There is significant difference among the three species of Gentiana expressed by the fingerprint patterns.The result of chemometric analysis indicated that 17 samples were classified into three categories.Conclusion:HPLC fingerprintcombined with chemometrics analysis is an effective method for the discrimination ofdifferentgroups of herbalmedicines.
Multiple sources;Gentianae macrophyllae Radix;HPLC fingerprint;chemometric methods;quality difference
R282
A
2096-2266(2017)06-0037-04
10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.009
(责任编辑李杨)
云南省教育厅科学研究基金资助项目(2014Z135);云南省应用基础研究计划项目(2016FD073);云南省中青年学术技术带头人后备人才资助项目(2015HB058);云南省科技计划资助项目(2012CG019;2014RE016)
2017-01-10
2017-03-21
张晓灿,硕士研究生,主要从事中药资源与鉴定研究.
*通信作者:段宝忠,副教授.