全反式维甲酸对哮喘小鼠气道炎症及辅助性T细胞17/调节性T细胞功能的影响*

王君丽， 韩 冰， 李小莉， 张丹丹

南方医科大学深圳医院呼吸内科，深圳 518100

全反式维甲酸对哮喘小鼠气道炎症及辅助性T细胞17/调节性T细胞功能的影响*

王君丽， 韩 冰， 李小莉， 张丹丹

南方医科大学深圳医院呼吸内科，深圳 518100

目的 研究全反式维甲酸对支气管哮喘小鼠气道炎症及辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)细胞功能的调节作用。方法 采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏和雾化吸入激发建立支气管哮喘小鼠模型，分别用全反式维甲酸及泼尼松干预治疗15 d(1次/d)，同时设立正常组及模型组。观察各组小鼠肺组织的炎症改变、细胞计数及肺泡灌洗液中IL-17、IL-10及TGF-β的含量。结果 泼尼松[7.5 mg/(kg·d)]组及全反式维甲酸高剂量[10 mg/(kg·d)]组肺部炎症改变较模型组明显减轻，全反式维甲酸低剂量[5 mg/(kg·d)]组炎症反应介于模型组及泼尼松组之间。模型组肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞计数均明显高于正常组；经泼尼松及高剂量全反式维甲酸干预后，细胞计数均明显下降，维甲酸低剂量组也呈下降趋势。模型组及全反式维甲酸低剂量组IL-17含量明显高于正常组，IL-10及TGF-β含量均低于正常组；而泼尼松组及全反式维甲酸高剂量组与正常组之间差异无统计学意义。与模型组相比，泼尼松组及全反式维甲酸高、低剂量组IL-17含量明显降低，IL-10及TGF-β的含量升高。泼尼松组及全反式维甲酸高剂量组各细胞因子之间无明显差异；与全反式维甲酸高剂量及泼尼松组相比，全反式维甲酸低剂量组IL-17含量升高，而IL-10及TGF-β含量降低。结论 全反式维甲酸可以通过调节Th17/Treg的细胞功能，从而改善哮喘小鼠的气道炎症反应，为治疗支气管哮喘提供新的干预措施。

支气管哮喘； 辅助性T细胞17； 调节性T细胞； 维甲酸

支气管哮喘是最常见的呼吸道慢性疾病之一，目前依然不能得到根治，给患者和社会造成沉重的医疗负担，严重影响患者生活质量。研究表明，辅助性T细胞17(Th17)可能是引起支气管哮喘激素抵抗的重要因素，调节性T细胞(Treg)在支气管哮喘患者体内数量减少，功能受到抑制。全反式维甲酸可通过影响Th17/Treg平衡，改善牙周炎及炎症性肠病等疾病，但对支气管哮喘Th17/Treg平衡失调的调节作用，国内外尚未见报道。我们建立支气管哮喘小鼠模型，研究全反式维甲酸对哮喘小鼠气道炎症及Th17/ Treg细胞功能的调节作用，以期为临床治疗哮喘提供一个新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

动物：SPF级健康雌性Balb/c小鼠60只，购于南京大学模式动物研究所，6～8周龄，体重18～22 g。药物及试剂：全反式维甲酸片(山东良福制药)，醋酸泼尼松片(山东新华制药)，氢氧化铝粉末(广东一力集团制药股份有限公司)，卵清蛋白(OVA)(华中海威基因科技有限公司)，小鼠IL-17、IL-10(Sigma-aldrich公司)、TGF-β(Thermo Fisher公司)ELISA试剂盒，苏木精-伊红(HE)染液(上海博谷生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 60只Balb/c小鼠按区组随机法分成5组，分别为正常组、模型组、泼尼松组、全反式维甲酸低剂量组、全反式维甲酸高剂量组，每组12只。

1.2.2 哮喘小鼠模型建立 参照McMillan等[1]于2004年发表的小鼠哮喘模型制作方法并加以改良，采用OVA腹腔注射致敏和雾化吸入激发。除正常组外，其余每组小鼠均于第1天腹腔内注射150 μL OVA悬液(100 mL生理盐水加入20 mg OVA及2.25 g氢氧化铝粉末，摇匀过夜)进行致敏，第14天重复致敏1次，第28天开始，以含1% OVA的PBS溶液通入雾化吸入箱，5 min后放入造模小鼠，雾化1 h进行激发，每天1次，连续激发5 d，正常组小鼠以生理盐水代替OVA悬液。

1.2.3 给药 各组小鼠均于第28天给予雾化1 h后，开始灌胃给药，每天1次，连续15 d。按照人和动物用药比例换算，泼尼松组给药量7.5 mg/(kg·d)，全反式维甲酸给药量5 mg/(kg·d)(低剂量组)及10 mg/(kg·d)(高剂量组)。正常组和模型组每天以等体积的生理盐水灌胃。

1.2.4 标本制备 最后一次给药结束后24 h，在全麻下，剪开胸骨，暴露胸腔，结扎右主支气管，行左侧支气管肺泡灌洗，分3次注入PBS溶液，每次0.4 mL，回收率大于85%为合格，获支气管肺泡灌洗液(BALF)。离心后，上清用于细胞因子测定，细胞沉渣PBS溶液重悬后测定细胞总数，瑞氏染色后，光学显微镜下计数200个白细胞，根据形态学特点进行分类计数。所有小鼠取右上肺组织浸入10%中性甲醛溶液中固定24 h，进行脱水及石蜡包埋，切片后即行HE染色观察肺组织的形态。

1.2.5 IL-17、TGF-β、IL-10含量的测定 用ELISA法测定BALF上清中IL-17、TGF-β、IL-10含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 全反式维甲酸对哮喘小鼠气道炎症的调节作用

2.1.1 HE染色结果 观察各组小鼠的肺组织切片HE染色发现：正常组小鼠气道上皮形态正常，管腔光滑，气道及周围血管组织无明显炎性细胞浸润，气道平滑肌未见增厚；模型组小鼠气道上皮不完整，气道黏膜水肿明显，气道及血管周围组织可见大量的炎性细胞浸润，管腔缩小，甚至完全闭塞，可见炎性分泌物，气管平滑肌明显增厚；泼尼松组及全反式维甲酸高剂量组可见轻度炎症改变，全反式维甲酸低剂量组炎症反应介于模型组及泼尼松组之间(图1)。

2.1.2 细胞计数 在各组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞计数也得到了与HE染色一致的结果。模型组各细胞计数均明显高于正常组；维甲酸高剂量组、维甲酸低剂量组及泼尼松组各细胞计数明显少于模型组；维甲酸高剂量组与泼尼松组无明显差异，而维甲酸低剂量组则明显高于维甲酸高剂量组和泼尼松组。以上差异均有统计学意义(均P<0.01)，结果如表1所示。

2.2 各组BALF中IL-17、IL-10及TGF-β的含量

检测各组小鼠BALF中IL-17、IL-10及TGF-β的含量，结果表明：模型组及全反式维甲酸低剂量组IL-17含量明显高于正常组，IL-10及TGF-β含量均低于正常组(均P<0.01)；而泼尼松组及全反式维甲酸高剂量与正常组之间无明显差异。与模型组比较，泼尼松组及全反式维甲酸高、低剂量组IL-17含量明显降低，IL-10及TGF-β的含量升高(P<0.05，P<0.01)。泼尼松组及全反式维甲酸高剂量组各细胞因子之间比较差异无统计学意义。与全反式维甲酸高剂量及泼尼松组相比，全反式维甲酸低剂量IL-17含量升高，而IL-10及TGF-β含量降低(P<0.05，P<0.01)。结果如表2所示。

A：正常组；B：模型组；C：泼尼松组；D：全反式维甲酸高剂量组；E：全反式维甲酸低剂量组图1 各组肺组织苏木精-伊红染色(×100)Fig.1 HE stain of lung tissue in each group(×100)

组别细胞总数嗜酸性粒细胞中性粒细胞正常组55.71±13.720.94±0.326.64±2.37模型组122.98±23.17**31.94±7.75**20.42±4.51**泼尼松组68.81±13.02##2.94±1.73##6.63±2.15##全反式维甲酸高剂量69.61±23.12##3.47±1.77##8.49±2.29##全反式维甲酸低剂量90.58±14.30**##△△▲▲15.33±4.78**##△△▲▲14.23±3.58**##△△▲▲F值25.426114.47544.099P值<0.01<0.01<0.01

与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与泼尼松组比较，△△P<0.01；与维甲酸高剂量组比较，▲▲P<0.01

组别IL-17IL-10TGF-β正常组11.18±3.7453.99±17.1220.27±7.14模型组29.56±8.92**22.82±6.44**6.58±2.97**泼尼松组11.93±5.14## 49.75±19.44##21.83±7.95##全反式维甲酸高剂量13.61±6.44## 55.77±24.56##21.70±8.64##全反式维甲酸低剂量18.84±8.33**##△ 33.36±14.02**△▲▲13.12±4.60**#△△▲▲F值15.0898.23012.287P值<0.01<0.01<0.01

与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05##P<0.01；与泼尼松组比较，△P<0.05△△P<0.01；与维甲酸高剂量组比较，▲▲P<0.01

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的呼吸道慢性疾病之一，随着全球哮喘防治创议(GINA)指南的推广，哮喘的防治较前取得了很大的进展，但依然不能得到根治，部分患者对现有的治疗方案反应性差，给患者和社会造成了沉重的医疗负担，严重影响患者生活质量。这一现状促使我们对哮喘的干预措施作进一步的研究，从而找到新的治疗方法。

我们选用全反式维甲酸干预支气管哮喘小鼠，众所周知，全反式维甲酸是体内维生素A的代谢中间产物，全反式维甲酸通过其受体发挥生物学效应，诱导人免疫调控转录因子FOXP3的表达，下调IL-17的表达，调节Th17 /Treg平衡，调控机体内免疫稳态。研究发现，维甲酸激动剂AM80可显著下调牙周炎小鼠牙周组织和局部淋巴结中IL-17A mRNA的表达水平，上调Treg细胞相关因子IL-10和TGF-β1mRNA的表达水平，并得以改善牙周炎[2]。维甲酸还可通过其受体影响Th17/Treg平衡，从而影响炎症性肠病的进程[3]。研究表明，维生素A制剂在体外可以调节儿童哮喘患者Th17/Treg细胞的功能[4]。

我们的实验结果表明，经过全反式维甲酸干预的小鼠，HE染色观察炎症反应及炎症细胞浸润等指标，均与泼尼松组无明显差异，说明全反式维甲酸干预可以减轻哮喘小鼠气道的炎症反应，这一结论与之前的研究结果类似[5]。但我们的实验设置了2种全反式维甲酸浓度，高浓度的全反式维甲酸[10 mg/(kg·d)]干预得到了与泼尼松组无差异的结果，低浓度[5 mg/(kg·d)]组虽可抑制气道炎症，但明显弱于泼尼松组及高浓度组，说明全反式维甲酸的调节作用与剂量呈正相关趋势。

为了进一步明确全反式维甲酸改善哮喘小鼠气道炎症的作用机制，我们检测了各组小鼠BALF中IL-17、IL-10及TGF-β的含量，结果表明，哮喘小鼠较正常组IL-17含量明显升高，而IL-10及TGF-β的含量明显降低，IL-17、IL-10及TGF-β分别是Th17及Treg细胞的主要效应因子，说明在哮喘小鼠中，确实存在Th17/Treg功能的紊乱。相较模型组，泼尼松组及全反式维甲酸高、低剂量组IL-17含量明显降低，而IL-10及TGF-β的含量明显升高，说明全反式维甲酸具有上调Treg细胞，同时抑制Th17功能的作用。

支气管哮喘发病机制比较复杂，Th1/Th2细胞失衡在支气管哮喘发病中的重要作用已明确[6]，但并不能完全解释支气管哮喘，研究证实Th17及调节性T细胞及其代表性细胞因子IL-17、IL-10等在免疫系统疾病的发病机制中起到重要作用，如类风湿性关节炎[7]、系统性红斑狼疮[8]、支气管哮喘[9-10]等疾病，我们的前期研究也得到了相似的结果[11]。另外，Th17细胞的异常很可能与激素抵抗型哮喘(SRA)的发生密切相关，Th17细胞通过分泌IL-17介导中性粒细胞炎症，从而在支气管哮喘的发病中起作用，而中性粒细胞性哮喘作为一种非Th2相关性哮喘是SRA的重要类型，故Th17可能是引起支气管哮喘激素抵抗的重要因素。调节性T细胞(Treg)作为机体的重要负调节机制，研究表明，在支气管哮喘患者体内Treg细胞不仅数量减少，功能也受到抑制[12]，Treg细胞可以抑制哮喘患者气道的炎症反应，并可以抑制Th17过度的抗原提呈反应。我们的前期研究也表明，在支气管哮喘患者外周血中确实存在Th17及Treg细胞的免疫紊乱[13]，由此可见，纠正Th17/Treg的平衡紊乱在SRA中具有重要意义。本研究发现全反式维甲酸可以减轻哮喘小鼠的气道炎症，可能与其调节哮喘小鼠Th17/Treg的细胞功能有关。

综上所述，我们的研究表明全反式维甲酸可能通过调节Th17/Treg的细胞功能，从而改善哮喘小鼠的气道炎症反应，这将为治疗支气管哮喘，尤其是激素抵抗性哮喘提供新的干预措施。

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(2017-03-07 收稿)

Effects of All Trans Retinoic Acid on Airway Inflammation and Th17/Treg Cell Function in Asthmatic Mice

Wang Junli，Han Bing，Li Xiaolietal

DepartmentofRespiration，ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity，Shenzhen518100，China

Objective To investigate effect of all trans retinoic acid (at-RA) on airway inflammation and Th17/regulatory T cell (Treg) function in asthmatic mice.Methods Bronchial asthma mouse model was established by sensitazation with intraperitoneal injection and stimulation with aerosol inhalation.The mice were treated with at-RA and prednisone for 15 days(once per day)，respectively.In addition to that，normal group and model group were established.Inflammation changes，cell counts and IL-17，IL-10 and TGF-β levels in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were observed in each group.Results Pulmonary inflammation was significantly allevated in prednisone group[7.5 mg/(kg·day)]and high dose at-RA group[10 mg/(kg·day)]as compared with model group.Inflammation of low dose at-RA group[5 mg/(kg·day)]was between that of modle group and prednisone group.Cell counts and IL-17，IL-10 and TGF-β levels in BALF were significantly higher in model group than in normal group.The cell count significantly descended in prednisone and high dose at-RA groups.Cell count also decreased in low dose at-RA group，but it was still higher than that in prednisone and high dose at-RA groups.In the model group and low dose at-RA group，the content of IL-17 was significantly increased while the content of IL-10 and TGF-β was significantly reduced as compared with the control group.And there was no significant difference between the prednisone group，high dose at-RA group，and normal group.Compared with the normal group，the content of IL-17 was significantly reduced while the content of IL-10 and TGF-β was significantly increased in prednisone group，high and low dose at-RA groups.There were no significant differences in cytokines between the prednisone group and high dose at-RA group.Compared with the prednisone group and high dose at-RA group，the content of IL-17 was significantly increased while the content of IL-10 and TGF-β was significantly reduced in low dose at-RA group.Conclusion At-RA can improve the airway inflammatory response of asthmatic mice by regulating the cellular function of Th17/Treg，thus providing new interventions for the treatment of bronchial asthma.

bronchial asthma； Th17； regulatory T cells； retinoic acid

*广东省深圳市卫生计生系统科研资助项目(No.201605021)

R562.25

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.014

王君丽，女，1982年生，主治医师，医学博士，E-mail：wangjunli0110@163.com