非诺贝特缓解非酒精性脂肪性肝病的体外机制研究

郭骏，陈玉媛，叶枫，李斌，徐传瑞，

1华中科技大学同济医学院药学院，武汉 4300302华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科，武汉 430030

非诺贝特缓解非酒精性脂肪性肝病的体外机制研究

郭 骏1， 陈玉媛1， 叶 枫2△， 李 斌1， 徐传瑞1，

1华中科技大学同济医学院药学院，武汉 4300302华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科，武汉 430030

目的 利用细胞模型研究非诺贝特在缓解非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的作用及其分子机制。方法 首先以0～0.9 mmol/L梯度浓度的油酸处理正常肝细胞LO2 48 h建立脂肪肝细胞模型；同时，以非诺贝特处理正常细胞或模型组细胞48 h，然后用CCK-8试剂盒测定细胞活力，用油红O染色观察细胞内脂滴形成或抑制情况，利用试剂盒检测细胞中的三酰甘油(TG)以及上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平，蛋白质免疫印迹法检测细胞中蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、FSAN及Nrf2蛋白水平，并使用2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞内的活性氧自由基(ROS)含量。结果 油酸浓度超过0.5 mmol/L后细胞活力显著降低，非诺贝特可抑制高浓度油酸对细胞的损伤。油酸处理后细胞中出现大量脂滴，细胞内TG含量以及上清液中的ALT、AST水平显著升高，给予非诺贝特处理后细胞中脂滴减少，TG、ALT和AST含量均显著降低。油酸处理后细胞中AKT、p-AKT、FSAN和Nrf2蛋白水平升高，给予非诺贝特可抑制上述蛋白水平的升高。同时，非诺贝特逆转了由油酸导致的细胞内ROS累积。结论 非诺贝特可以抑制油酸引起的脂肪积累，并缓解脂肪累积导致的细胞损伤，其机制是通过下调AKT/FSAN信号通路，从而降低ROS水平，进而减少ROS导致的细胞损伤。

非酒精性脂肪性肝病； 非诺贝特； 蛋白激酶B(AKT)； 活性氧自由基

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一类与乙醇摄入以及丙型肝炎病毒等其它明确肝损伤因素无关的、以肝细胞脂肪变性及脂质蓄积为特点的肝脏疾病[1]。随着生活水平提高，世界范围内的肥胖人群越来越多[2]，欧洲地区有超过50%人群超重，23%的女性以及20%的男性为肥胖人群[3]。成年肥胖人群中NAFLD的发病率高达80%～90%[4]，其中40%～50%发展为肝纤维化[5]，NAFLD正严重威胁人类健康。虽然有大量研究聚焦于此，但是对于其发病机制以及过程所知有限[6]。非诺贝特已应用于临床多年，具有良好的降低血脂功能。同时，研究发现非诺贝特可以抑制非酒精性脂肪肝发展并缓解非酒精性脂肪肝肝炎，但其作用机制还不清楚[7]。本研究中，我们建立了NAFLD的体外模型，并利用该模型研究了非诺贝特对NAFLD的保护作用及其分子机制。我们的结果显示非诺贝特的降脂作用抑制了蛋白激酶B(AKT)信号通路，并降低了活性氧自由基(ROS)水平，进而减少了ROS导致的肝损伤。因此我们的研究在细胞水平上揭示了非诺贝特治疗NAFLD的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人正常肝细胞LO2购自武汉大学细胞典藏中心；DMEM培养液以及胎牛血清均购自美国Gibco公司；三酰甘油(TG)测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒以及天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；细胞活力测定试剂盒CCK-8、油红O、油酸、DCFH-DA均购于美国Sigma公司；非诺贝特购自百灵威科技有限公司；AKT、p-AKT、FSAN、Nrf2以及β-actin蛋白抗体均购自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及NAFLD模型的建立 LO2细胞接种于含10%胎牛血清(FBS)以及100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度环境下进行培养。待细胞汇合达75%后用含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)浓度为0.25%的胰酶进行消化后传代培养。取处于对数生长期的LO2细胞进行铺板，12孔板按5×104/孔接种细胞，待细胞生长24 h后，对细胞进行换液，同时按照油酸浓度为0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mmol/L的梯度进行给药，继续培养24 h后，进行油红O染色，观察细胞内脂滴的分布情况，当油酸浓度到达0.5 mmol/L时，与对照组相比，细胞内脂滴明显增多，差异显著，由此确定LO2细胞NAFLD模型造模成功。

1.2.2 CCK-8试剂盒检测细胞活力 取汇合达75%生长良好的LO2细胞，利用胰酶消化后加入适量培养液调整细胞悬液浓度为5×104/mL，之后以100 mL/孔的量接种于96孔板中进行培养，预培养24 h待细胞完全贴壁生长后加入不同浓度的油酸或非诺贝特继续培养48 h，之后加入CCK-8溶液使其终浓度为10 μg/mL，37℃孵育1.5 h，在450 nm波长下测定吸光度(A)值计算细胞活力。细胞活力(%)=(A给药-A空白)/(A0给药-A空白)×100%。其中，A给药：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培养液和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；A0给药：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

1.2.3 油红O染色观察细胞内脂滴 取汇合达75%生长良好的LO2细胞，利用胰酶消化后加入适量培养液调整细胞悬液浓度，按5×104/孔接种于12孔板中，预培养24 h待细胞完全贴壁生长后加入不同浓度的油酸或非诺贝特继续培养48 h，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞2次后加入10%中性甲醛固定10 min，加入油红O溶液避光孵育15 min，去除染液加入75%乙醇浸没5 min，PBS冲洗2次后加入苏木精染液复染1 min，双蒸水漂洗2次后显微镜下观察拍照。

1.2.4 TG、ALT、AST试剂盒检测TG及培养上清ALT及AST水平 取汇合达75%生长良好的LO2细胞，利用胰酶消化后加入适量培养液调整细胞悬液浓度，按105/孔接种于6孔板中，预培养24 h后加入不同浓度的油酸或非诺贝特继续培养48 h，之后收集上清液利用试剂盒测定ALT及AST。PBS浸润下将细胞刮下再利用超声破碎细胞，利用试剂盒测定细胞中TG水平。

1.2.5 Western blot检测细胞AKT、p-AKT、FSAN、Nrf2蛋白含量 如1.2.4项所述用油酸或非诺贝特处理细胞，之后加入含蛋白酶抑制剂(cocktail)的裂解液冰上裂解细胞，离心收取上清液后利用BCA试剂盒测定相应蛋白浓度，所有样品根据蛋白定量结果上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后，低脂牛奶孵育后分别进行一抗和二抗杂交。然后胶片曝光分析各个样品中蛋白的相对含量并以蛋白β-actin作为内参。即测量各条带的吸光度，以目的蛋白与内参蛋白β-actin吸光度的比值来反映目的蛋白的相对表达量。

1.2.6 ROS试剂盒检测细胞ROS含量 如1.2.4项所述用油酸或非诺贝特处理细胞，之后去除培养液，加入无血清培养液配制的终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA溶液，于37℃孵育20 min后，以无血清培养液洗涤3次，于荧光显微镜下观察荧光的强弱并使用酶标仪测定吸光度值进行定量分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 非诺贝特抑制油酸导致的细胞损伤

首先建立了NAFLD细胞模型并检测了高脂培养下的细胞活力。如图1所示，当油酸浓度超过0.4 mmol/L后随着油酸浓度升高LO2细胞活力迅速降低，当浓度达到0.9 mmol/L时LO2的细胞活力小于对照组的10%。结果表明，高浓度的油酸具有细胞毒性。油酸浓度为0.9 mmol/L时细胞活力值低于对照组的10%，不利于观察非诺贝特的逆转作用，0.6 mmol/L时细胞活力为对照组的40%，细胞本身就可恢复活力，不利于观察非诺贝特的保护作用，而0.8 mmol/L时细胞活力约为对照组的25%，故选择0.8 mmol/L的油酸浓度用于后续实验。

非诺贝特处理对细胞活力的影响如图1所示，0.8 mmol/L油酸可显著抑制LO2的细胞活力，而给予非诺贝特进行干预可部分恢复LO2的细胞活力且呈现浓度依赖性，当非诺贝特浓度达到20 mmol/L时细胞活力可恢复至80%以上。该结果说明，在利用油酸制备的NAFLD细胞模型中，非诺贝特可以有效抑制细胞损伤。

与正常组比较，**P<0.01；n=3图1 油酸及非诺贝特对LO2细胞活力的影响Fig.1 Effects of oleic acid and fenofibrate on cell viability of LO2

2.2 非诺贝特抑制胞内脂滴累积

在给予油酸处理LO2细胞48 h后进行油红O染色以观察细胞内脂滴的累积情况。如图2所示，对照组细胞形态规则，胞质内无明显红色或仅为淡红色；而油酸处理后的细胞可观察到随油酸浓度的升高细胞内红色加深，范围扩大。0.8 mmol/L油酸诱导的同时给予非诺贝特进行干预，可见细胞内的红色变淡，范围变小。这些结果表明高浓度油酸可以导致脂肪在细胞内大量累积，而非诺贝特可以抑制脂肪在细胞内的累积。

A：0 mmol/L油酸；B：0.2 mmol/L油酸；C：0.4 mmol/L油酸；D：0.8 mmol/L油酸；E：0.8 mmol/L油酸+20 mmol/L非诺贝特图2 油红O染色观察LO2细胞内脂滴(×200)Fig.2 LO2 cells are stained with oil red O and observed by microscope(×200)

2.3 非诺贝特显著降低细胞中TG含量

如图3所示，油酸可诱导细胞内TG的大量积累，且细胞内TG含量随油酸浓度升高而升高，呈现浓度依赖性。在给予非诺贝特干预后细胞中的TG含量有一定的下降，且非诺贝特浓度为20 mmol/L时，TG含量下降最明显。该结果说明非诺贝特抑制了细胞内TG的合成。

与正常组比较，*P<0.05 **P<0.01，与0.8 mmol/L油酸组比较，##P<0.01；n=3图3 油酸及非诺贝特对LO2细胞中TG含量影响Fig.3 Effects of oleic acid and fenofibrate on TG level in LO2 cells

2.4 细胞培养上清液中ALT及AST含量变化

如图4所示，给予油酸处理48 h后，上清液中ALT及AST变化趋势一致，随油酸浓度的升高而升高。在给予非诺贝特干预后，ALT及AST变化趋势依然保持一致，与0.8 mmol/L油酸组相比，加入非诺贝特干预后上清液中的ALT及AST含量显著降低，接近正常组含量。这说明非诺贝特确实抑制了高脂导致的细胞损伤。

2.5 非诺贝特降低细胞AKT、p-AKT、FASN及Nrf2含量

在油酸处理以及非诺贝特干预后利用Western blot检测了细胞中AKT、p-AKT、FASN及Nrf2蛋白含量变化。结果如图5所示，油酸处理后细胞中与脂质合成和代谢相关的信号通路蛋白AKT、p-AKT以及FASN酶均显著升高，而在给予非诺贝特干预后与单独油酸处理组相比，细胞中的AKT、p-AKT及FASN的蛋白含量均明显下降。油酸处理后细胞中促进氧化应激的蛋白Nrf2上调，而加入非诺贝特后Nrf2显著降低。这些结果说明非诺贝特抑制了脂肪合成后，下调了AKT相关通路以及与氧化应激相关的Nrf2因子水平。

2.6 非诺贝特降低细胞内ROS含量

给予油酸及非诺贝特处理48 h后通过DCFH-DA染色后在荧光显微镜下观察，同时使用酶标仪定量分析比较油酸以及非诺贝特对LO2细胞内ROS含量的影响。结果如图6所示，给予0.8 mmol/L油酸处理后细胞内ROS水平显著上升，而在非诺贝特的干预后ROS降低至接近正常细胞水平。

与正常组比较，*P<0.05 **P<0.01；与0.8 mmol/L油酸组比较，#P<0.05 ##P<0.01；n=3图4 油酸及非诺贝特作用下上清液中ALT、AST含量变化Fig.4 Effect of oleic acid and fenofibrate on ALT and AST levels in supernatant

图5 LO2细胞中AKT、p-AKT、FASN、Nrf2蛋白含量Fig.5 Protein expression levels of AKT，p-AKT，FASN and Nrf2 in LO2 cells

3 讨论

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前研究最热门的疾病之一，也是我国愈来愈常见的慢性肝病，发病率高达20%～27%[8]。NAFLD是一种以TG为主的脂类物质在肝脏中蓄积导致病理改变的肝脏疾病[9]，临床上还伴有血清中ALT及AST升高，并将此作为诊疗依据之一[10-12]。

A：显微镜下观察细胞荧光(×200)；B：酶标仪定量检测荧光强度；与正常组比较，**P<0.01；与0.8 mmol/L油酸组比较，##P<0.01；n=6图6 DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平Fig.6 ROS level in LO2 cells detected by DCFH-DA staining

非诺贝特是一种氯贝丁酸衍生物类血脂调节药，通过抑制极低密度脂蛋白和TG的生成并同时促进其分解代谢，进而降低血低密度脂蛋白、胆固醇和TG水平。在近些年的一些研究中，逐渐发现非诺贝特对NAFLD有一定的治疗作用[7，13]。这说明非诺贝特可以抑制脂肪在肝脏中的积累，并抑制脂肪肝导致的损伤，但其作用机制还不甚清楚。

本研究中，我们利用NAFLD细胞模型，首先观察了非诺贝特对高脂LO2细胞活力的影响。我们发现油酸对LO2具有显著的细胞毒性，而非诺贝特处理后细胞活力得到恢复，这与其对NAFLD的治疗特性一致[14-15]。这个结果也说明利用细胞模型研究非诺贝特对NAFLD的保护机制是可行的。

我们进一步研究了非诺贝特对脂肪肝脂肪积累的影响以及抑制肝损伤的作用。通过油红O染色观察到油酸诱导LO2细胞中的脂滴大量累积，同时测得TG、ALT、AST含量升高，所有结果均表明本研究中建立的体外模型与临床实际表现一致。在给予非诺贝特干预后细胞内脂滴减少、TG、ALT、AST含量降低，这些结果表明非诺贝特抑制脂肪积累后降低了脂肪积累导致的肝脏损伤。

大量研究表明NAFLD的发生发展与PI3K/AKT信号通路激活[16-17]以及氧化应激[18-19]密切相关，且脂肪酸合成酶作为脂肪酸合成代谢的限速酶在NAFLD的发生发展中也扮演着重要角色[20-21]，通过检测油酸以及非诺贝特处理后细胞中的AKT、p-AKT、FASN等脂肪合成相关蛋白，证实了非诺贝特可以逆转由油酸诱导的AKT信号通路的活化。

另外，大量文献报道脂肪合成过多会导致胞内ROS水平上升，从而导致肝脏损伤[18-19]。我们的研究也显示非诺贝特处理后，细胞内的ROS水平显著下降，同时ROS相关细胞因子Nrf2水平也显著降低，这些结果表明非诺贝特对脂肪性肝炎的保护作用与下调ROS水平、抑制氧化应激导致的细胞损伤有关。

综上所述，本研究通过油酸诱导LO2细胞建立了NAFLD的体外模型，并利用该模型研究非诺贝特对脂肪性肝炎的保护作用机制。我们的结果在细胞水平证实了非诺贝特通过下调AKT/FSAN信号通路和降低ROS积累，达到降低脂肪积累和减轻细胞损伤的作用。

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(2017-02-20 收稿)

Therapeutic Effects of Fenofibrate on Nonalcoholic Fatty Liver Diseaseinvitroand Related Mechanism

Guo Jun1，Chen Yuyuan1，Ye Feng2△etal

1DepartmentofPharmacyTongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofPediatrics，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate the role of fenofibrate in treating non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)in cellular model and the related mechanism.Methods NAFLD cell model was established by treating LO2 cells with oleic acid (from 0 to 0.9 mmol/L).The cells were treated with fenofibrate (from 0 to 20 mmol/L)for 48 h.CCK-8 kit was used to determine the LO2 cell viability with or without treatment.Oil Red O staining was used to observe lipid droplets in LO2 cells microscopically.Lab-used experiment kits were used to assess TG level in cells and ALT，AST levels in cell supernatants.Protein levels of AKT，p-AKT，FSAN and Nrf2 were detected using Western blotting.DCFH-DA was used to detect reactive oxygen species(ROS)in cells.Results Oleic acid with concentration over 0.5 mmol/L significantly inhibited cell viability.Fenofibrate significantly reversed cytotoxicity induced by high concentration of oleic acid.Lipid droplets and TG within LO2 cells，and ALT/AST in cell supernatant were increased by treatment with oleic acid.Fenofibrate reversed the increase of lipid drops，TG，ALT and AST induced by oleic acid.Oleic acid up-regulated the levels of AKT，p-AKT，FSAN and Nrf2，while fenofibrate reversed the up-regulation of those proteins.Fenofibrate reduced the oleic acid-induced accumlation of ROS in cells.Conclusion Fenofibrate can inhibit lipid accumulation and alleviate cell damage induced by oleic acid through inhibiting AKT/FSAN pathways and reducing ROS levels.

non-alcoholic fatty liver disease； fenofibrate； AKT； reactive oxygen species

R575.5

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.005

郭 骏，男，1993年生，硕士研究生，E-mail：1270079810@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：doctoryf@126.com