黄颡鱼源海豚链球菌分离、鉴定及药敏特性

杨移斌，胥 宁，杨秋红，刘永涛，董 靖，艾晓辉，*

(1.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223； 2.淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430223)

黄颡鱼源海豚链球菌分离、鉴定及药敏特性

杨移斌1，2，胥 宁1，2，杨秋红1，2，刘永涛1，2，董 靖1，2，艾晓辉1，2，*

(1.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223； 2.淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430223)

为探明福建漳州某养殖场暴发黄颡鱼大量死亡的病因，为该疫病的防控提供参考。从患病黄颡鱼肝、肾及脾分离纯化病原菌，经理化特性测定及16S rRNA 序列分析对其进行鉴定，开展人工感染试验，并利用纸片扩散法进行药敏特性分析。结果显示，分离菌株si222对黄颡鱼的LD50为2.63×104cfu·g-1，其理化特性与海豚链球菌(Streptococcusiniae)基本一致，16S rRNA序列与海豚链球菌同源性为100%，综合判定分离菌株为海豚链球菌。菌株si222对苯唑西林、头孢拉定、克林霉素及氯霉素利福平等11种抗生素高度敏感；对青霉素、阿莫西林、磺胺异噁唑及氟苯尼考等6种抗生素耐药。分离菌株si222是黄颡鱼病原菌，养殖时可选用庆大霉素及多西环素等药物进行防控。

海豚链球菌；黄颡鱼；人工感染；药敏特性

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，俗称黄腊丁等，其分类地位为鲶形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)[1]。黄颡鱼是重要的淡水经济鱼类，其肉质鲜美，富含多种营养成分，又无肌间刺，深受广大消费者喜爱。黄颡鱼是广温性鱼类，能适应中国大部分地区养殖环境，故黄颡鱼近年来在国内养殖区域、规模及密度不断扩大。随着黄颡鱼养殖业的快速发展，养殖规模及密度不断增加，导致黄颡鱼养殖水域环境急剧变化，养殖黄颡鱼不断出现各种病害。

目前报道的黄颡鱼细菌病原主要有迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)[2]、鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)[3]、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophilia)[4]、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)[5]、温和气单胞菌(Aeromonassobria)[6]、柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)[7]及蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)[8]等，病原的多样性常导致病害难以及时有效防控，从而引起较大经济损失，故病害成为了黄颡鱼养殖业发展的一大障碍。

2016年7至8月福建漳州某黄颡鱼养殖场暴发养殖黄颡鱼大量死亡，发病率在40%～60%，病鱼死亡率接近90%，发病黄颡鱼在口腔与下颌、体表两侧及鳍条基部均有出血症状，肛门红肿有红色液体流出；解剖可见肝肾脾等出现肿胀、充血，部分病鱼有腹水，本研究在发病黄颡鱼体内分离到1株优势菌，进行了人工感染实验及鉴定，确定了分离菌株的种类，并对其药物敏感特性进行了测定，以期为该病的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼

带有典型症状的发病黄颡鱼8尾采自福建漳州黄颡鱼养殖场；健康黄颡鱼(30±1.5)g购于武汉某水产市场，健康黄颡鱼无伤病，活力强，暂养于实验室鱼缸7 d后无异常。

1.1.2 试剂及仪器

水解酪蛋白琼脂(MH)、脑心浸出液(BHI)及其琼脂培养基(BHIA)、革兰氏染色液、药敏纸片及细菌生化微量鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；PCR所用试剂、特异性引物及细菌基因组DNA提取试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 临床调查

对暴发死亡黄颡鱼养殖场养殖环境、发病史进行调查。

1.2.2 病原菌分离

取具有典型症状病鱼8尾，在无菌条件下，取肝、肾、脾画线于脑心浸出液平板上，置于恒温28 ℃培养1～3 d，挑取形状、大小及颜色基本一致的菌落用于再纯化，最终获得分离菌株的纯培养物。纯培养物加入25%的甘油混匀后置于-80 ℃保存。分离菌株暂命名为si222。

1.2.3 人工感染及LD50测定

人工感染。将si222菌株接种于BHIA培养基上， 放置在28 ℃恒温培养箱中36 h，用无菌生理盐水洗下菌苔，并参照麦氏比浊法调整菌悬液浓度为4.5×108cfu·mL-1。

将感染黄颡鱼分为两组，每组均设置3个重复，每个重复10尾鱼[10]。连续充氧，水温控制在25～28 ℃。实验组黄颡鱼腹腔注射si222菌液0.1 mL·尾-1，对照组腹腔注射等量无菌生理盐水。间隔3 h观察黄颡鱼游泳状况，对发病死亡鱼进行解剖观察，并进行细菌再分离。

细菌LD50测定。将分离菌株制成浓度为2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105cfu·mL-1的菌悬液，分别注射到不同组黄颡鱼体内，每尾0.1 mL，即各组每尾注射剂量分别为2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104cfu，对照组注射等量无菌生理盐水，每组的实验鱼各10尾。持续观察实验鱼的活动情况，及时记录发病死亡数，并用概率单位图解法[11]计算半致死剂量(LD50)。

1.2.4 生理生化特性测定

将分离菌株在BHIA平板上画线，置于28 ℃恒温培养箱中培养36 h后，观察菌落大小、形态特征及其颜色，并进行革兰氏染色，采用细菌生化微量鉴定参照《伯杰氏系统细菌学手册》[12]测定生理生化指标。

1.2.5 分离菌株16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

将分离菌株接种于BHI，置于摇床恒温28 ℃培养24 h，菌液经高速离心后收集菌体，提取DNA作为PCR扩增模板。细菌16S rDNA序列扩增通用引物为27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。参照王小亮等[10]方法进行PCR反应扩增目的基因。扩增产物确定为目的片段后送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化及序列测定。

将si222株16S rDNA基因序列放到NCBI中进行比对，根据比对结果下载同源性较高的序列采用Clustal X软件进行多序列匹配分析，通过MEGA5.1软件Neighbor-Joining法构建系统进化树，1 000次Bootstrap检验置信度。

1.2.6 药敏特性分析

药敏实验采用纸片琼脂扩散法，参照NCCLS抗微生物药物敏感性实验执行标准[13]进行。将分离菌株接种于脑心浸出液培养基，28 ℃振荡培养24 h，用无菌生理盐水调整菌悬液浓度为2.0×107cfu·mL-1，取200 μL菌液均匀涂于MH平板上，贴上不同的药敏纸片，28 ℃培养24 h后测量药物抑菌圈直径，参照杭州微生物公司药敏纸片说明书进行敏感度判定。

2 结果与分析

2.1 临床调查

自然发病黄颡鱼养殖场养殖面积约6.67 hm2，放养密度为18 g苗30万尾·hm-2，单养黄颡鱼，其所处区域黄颡鱼养殖近200 hm2，其中养殖场发病2.67～4.00 hm2，发病期持续近1个月，死亡率达到90%，导致严重经济损失。发病池水温26～28 ℃，氨氮0.3 mg·L-1，亚硝酸盐0.05 mg·L-1。

2.2 细菌分离与致病性分析

从患病黄颡鱼肝、肾及脾中分离到一株优势菌si222。经人工感染实验，注射浓度为4.5×108cfu·mL-1si222菌液的实验组黄颡鱼第1天即出现死亡，3 d内死亡率达100%，而对照组未出现异常。感染发病死亡黄颡鱼出现体表出血，内脏严重充血肿大等症状，与自然发病症状相似，如图1所示，并且细菌再分离实验获得了与菌株si222相同的菌株，表明菌株si222是黄颡鱼的病原菌。参照表1建立的实验鱼死亡率(%)与细菌剂量对数[lg(cfu)]的关系曲线：y=0.22x-0.808(图2)，分离菌株si222对黄颡鱼半数致死剂量LD50=7.9×105cfu·尾-1，即LD50=2.63×104cfu·g-1。

图1 自然发病(A)和人工感染(B)黄颡鱼解剖图Fig.1 The anatomical image for natural sicked (A) and artificial infected (B) Pelteobagrus fulvidraco

表1 分离株对黄颡鱼LD50试验结果

Table 1 Results of LD50of isolated strain inPelteobagrusfulvidraco

组别Group细菌剂量Injecteddose/(cfu·fish-1)实验鱼数量Fishnumber死亡数量Amountofdeath1d2d3d4d5d6d7d死亡率Mortality/%A2.5×108108200000100B2.5×10710531000090C2.5×10610211000060D2.5×10510011100030E2.5×10410000110020F0.65%生理盐水Physiologicalsaline1000000000

图2 黄颡鱼死亡率与细菌剂量对数的关系曲线Fig.2 The relation curve of Pelteobagrus fulvidraco mortality with logarithm of bacterial dose

2.2 细菌鉴定

分离菌株si222革兰氏染色呈现蓝紫色，表明分离菌株为革兰氏阳性菌，在脑心浸出液平板上28 ℃培养48 h的菌落为白色、透明、圆形、直径为0.2～0.8 mm。具体生理生化指标如表2，生理生化指标测定结果初步判断si222菌株为海豚链球菌Streptococcusiniae。将菌株si222的16S rRNA基因序列与NCBI中已有16S rRNA序列进行比对，结果显示，si222株与链球菌属种类同源性最高，选取同源性高的链球菌属16S rRNA序列，通过构建系统发育树分析(图3)，其结果显示，si222株与海豚链球菌Streptococcusiniae聚为一支，同源性最高，为100%。因此结合生理生化特性将si222株判定为海豚链球菌Streptococcusiniae。

表2 菌株si222的生理生化试验结果

Table 2 Results of biochemical characteristics of strain si222

试验项目Testitemssi222海豚链球菌[10]Streptococcusiniae试验项目Testitemssi222海豚链球菌[10]StreptococcusiniaeVp试验Vpexperiment--蜜二糖Melibiose--脲酶Urease--菊糖Inulin--水解七叶灵++蔗糖Sucrose++Hydrolysisofesculin氧化酶Oxidase--葡萄糖Glucose++阿拉伯糖Arabinose--海藻糖Trehalose++水杨苷Salicin++D-木糖D-xylose++乳糖Lactose--甘油醇Glycols++接触酶Catalase--山梨醇Sorbitol--45℃生长45℃growth--核糖Ribose++10℃生长10℃growth++

“+”，阳性； “-”，阴性。

“+”， Positive； “-”， Negative.

图3 基于si222株和其他相关菌株16S rRNA 基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of si222 strain and its relative strains

2.3 药敏特性

药敏实验结果表明，分离菌株si222对苯唑西林、头孢拉定、克林霉素及利福平等11种抗生素高度敏感；对青霉素、阿莫西林、磺胺异噁唑及氟苯尼考等6种抗生素耐药。具体见表3。

表3 si222药敏试验结果

Table 3 Antibiotic sensitivity test of strain si222

药物Drug抑菌圈直径判断标准Thestandardofinhibitionzonediameter/mm不敏感Resistant中度敏感Mediumsensitive高度敏感Highlysensitive药物含量Dose/(μg·disc-1)抑菌圈直径Inhibitionzonediameter/mm敏感性Sensitivity苯唑西林Oxacillin≤1011～12≥13118S青霉素Penicillin≤1920～27≥2810U19R头孢拉定Cefadroxil≤1415～17≥183029S阿莫西林Amoxicillin≤1314～17≥182013R磺胺异噁唑Sulfisoxazole≤1213～16≥173000R氟苯尼考Florfenicol≤1213～17≥18750R克林霉素Clindamycin≤1415～20≥21232S利福平Rifampicin≤1617～19≥20534S头孢噻肟Cefotaxime≤1415～22≥233035S新霉素Neomycin≤1213～16≥173024S卡那霉素Kanamycin≤1314～17≥18300R多西环素Doxycycline≤1213～15≥163030S左氧氟沙星Levofloxacin≤1314～16≥17520S链霉素Streptomycin1≤1112～14≥151022S妥布霉素Tobramycin≤1213～14≥15100R庆大霉素Gentamicin≤1213～14≥151023S阿米卡星Amikacin≤1415～16≥173029S

S，高度敏感；R，耐药；U，青霉素的含量以单位计。

S， Highly sensitive; R， Resistant; U， Penicillin content measures in unit.

3 讨论

随着黄颡鱼养殖产业不断发展，养殖环境日益恶化，细菌性病害频发。本研究从自然发病黄颡鱼体内分离到致病菌，通过形态学、理化特性及16S rRNA基因分析，综合判定分离菌株si222为海豚链球菌(Streptococcusiniae)，通过回归感染实验，确定海豚链球菌为黄颡鱼病原菌。

海豚链球菌分类地位为芽孢杆菌纲、乳杆菌目、链球菌科、链球菌属[14]，1976年由Pier和Madin[15]从美国旧金山市某水族馆一头亚马孙淡水海豚皮下脓肿中首次分离并定种。其流行区域及可感染鱼种类多样，目前已经报道的种类有杂交鲟[10]、西伯利亚鲟[16]、罗非鱼[17]、鲈鱼[18]、杂交鳢[19]、斑点叉尾鮰[14]及半滑舌鳎[20]等，给水产养殖业带来巨大经济损失。据文献报道海豚链球菌感染不同种类宿主其主要症状具有一定的差异[16]，在感染哺乳动物时主要表现蜂窝组织炎、脑膜炎及皮下脓肿等，而在鱼类主要表现为眼球突出、全身性败血及脑膜炎等[21]。本研究发现海豚链球菌自然感染黄颡鱼导致其体表及重要组织器官出现以出血及病变为主要特征的败血症状，符合海豚链球菌感染鱼类致病的症状，目前国内未见相关的系统报道。链球菌在养殖环境中是普遍存在的[22]，发病与养殖水温、养殖环境及养殖密度有着密切的关系，一般认为水温在25 ℃及以上链球菌就会导致水生动物发病[23]。福建漳州地区养殖黄颡鱼规模大，集约化程度高，导致养殖密度高、环境差，而每年的7—8月份养殖水温都远远超过25 ℃，适合链球菌的生长繁殖。

对于细菌鉴定目前通用的方法主要有传统生理生化特征测定、细菌自动鉴定仪及16S rRNA基因鉴定。由于当今商业细菌鉴定仪都没有收录海豚链球菌，故不能使用此法进行海豚链球菌鉴定[16]，而细菌不同鉴定方法各有优势和缺陷，科学鉴定方法一般是将测定细菌理化特征及16S rRNA基因分析结合起来[24]。本研究在革兰氏染色观察及形态学研究结果基础上，参照《伯杰氏系统细菌学手册》链球菌属理化指标，通过微量生化反应管测定了海豚链球菌的理化特性；并对分离菌株si222的16S rRNA基因进行扩增及测序，进行Blast比对及系统发育分析，结合二者的优势，综合鉴定分离菌株si222为海豚链球菌，结果准确、科学、客观。

本研究测定了分离菌株si222对苯唑西林、头孢拉定、克林霉素及利福平等11种抗生素高度敏感；对青霉素、阿莫西林、磺胺异噁唑及氟苯尼考等6种抗生素耐药。实验结果中菌株si222对阿莫西林、氟苯尼考及诺氟沙星等耐药，与邓梦玲等[16]研究结果不同；菌株si222对庆大霉素、多西环素等高度敏感与邓梦玲等[16]、陈言峰等[19]报道相同。药敏实验结果存在差异，可能是因为菌株来源、地理环境及用药情况等不同造成的。根据药敏实验结果，选择水产用多西环素参照说明书使用，连续伴饵投喂7 d停止死亡，经观察后养殖黄颡鱼逐步恢复正常。虽然目前在水生动物病害治疗时，药物治疗仍然是治愈病害的主要手段之一，但随着各种细菌性病害暴发，药物滥用，耐药菌株不断产生，而且在环境中还会形成残留，给养殖户有效防控水生动物病害带来困难同时带来环境问题。为此，在疾病诊断时应及时鉴定病原，了解病原的耐药性，寻找高度敏感药物，从而做到科学用药，保障水产品质量安全。

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(责任编辑 卢福庄)

Isolation， identification and antibiotic sensitivity ofStreptococcusiniaefromPelteobagrusfulvidraco

YANG Yibin1，2， XU Ning1，2， YANG Qiuhong1，2， LIU Yongtao1，2， DONG Jing1，2， AI Xiaohui1，2，*

(1.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Wuhan430223，China; 2.HubeiFreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenter，Wuhan430223，China)

The study was aimed to investigate the cause about the outbreak of numerous deaths ofPelteobagrusfulvidracoat a fishery farm in Zhangzhou， Fujian Province， and to provide reference for the prevention and control of the disease forPelteobagrusfulvidraco. The pathogenic bacteria were isolated and purified from liver， kidney and spleen of sickPelteobagrusfulvidraco. And the identification of the strain si222 was conducted， using the biochemical identification and 16S rRNA gene sequence determination. The artificial infection test was performed， and the antimicrobial susceptibility test was conducted by disc diffusion method. The results showed that strain si222 was the pathogens ofPelteobagrusfulvidraco， the LD50of the isolate was counted to 2.63×104cfu·g-1. According to morphological and biochemical characteristics as well as the result of 16S rRNA gene sequence analysis， the isolated strain si222 wasStreptococcusiniae. Strain si222 was susceptible to oxacillin， cefadroxil， clindamycin and rifampicin and other 11 kinds of antibiotics. Meanwhile， it showed resistance to penicillin， amoxicillin， sulfisoxazole， florfenicol and other 6 kinds of antibiotics. The isolated strain si222 was the pathogenic bacteria toPelteobagrusfulvidraco， and the disease can be prevented by administering drugs such as gentamicin and doxycycline in fisheries farming.

Streptococcusiniae;Pelteobagrusfulvidraco; artificial infection; antibiotic sensitivity

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.07

2016-12-13

公益性行业(农业)科研专项(201203085)

杨移斌(1988—)，男，江西抚州人，硕士，助理研究员，从事水生动物医学研究。E-mail: yangyb1988@126.com

*通信作者，艾晓辉，E-mail: aixh@yfi.ac.cn

S941.42

A

1004-1524(2017)06-0903-07