氨氧化菌的分离鉴定及其在罗氏沼虾育苗废水中的应用

2017-07-03潘晓艺蔺凌云尹文林姚嘉赟袁雪梅郑群艳沈锦玉

浙江农业学报 2017年6期

关键词：沼虾进化树罗氏

潘晓艺，蔺凌云，尹文林，徐洋，姚嘉赟，袁雪梅，郑群艳，沈锦玉

(浙江省淡水水产研究所，农业部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江湖州 313001)

氨氧化菌的分离鉴定及其在罗氏沼虾育苗废水中的应用

潘晓艺，蔺凌云，尹文林，徐洋，姚嘉赟，袁雪梅，郑群艳，沈锦玉*

(浙江省淡水水产研究所，农业部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江湖州 313001)

氨氧化菌；人苍白杆菌；反硝化；生物脱氮；亚硝酸还原酶基因

氮循环是生物圈中最基本的物质循环之一，它是通过许多种微生物催化的不同反应相互作用而实现的。核心氮循环包括4个还原途径和2个氧化途径[1-2]，其中氨的氧化是重要途径之一。自然界中存在多种氨氧化微生物，例如亚硝化单胞菌和亚硝化菌，能将氨氧化成亚硝酸盐，并且在该代谢过程之后，亚硝酸盐氧化微生物在有氧条件下将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。水体中的氮循环是水质修复和自净的主要途径。我国是水产养殖大国，在养殖过程中采取的高密度集约化养殖模式，使得养殖水体中过剩的饵料和动物的排泄物造成水体中氨氮、亚硝酸盐氮等含量严重超标，进而导致鱼体抗病力、抗应激能力下降，病害频发。养殖水体中过量的氮不但影响水产养殖的成功率，也间接影响养殖外河的水质，因此养殖废水的脱氮处理对水产养殖业及环境保护具有重要意义。

在水产养殖过程中养殖水的脱氮处理主要有化学药物氧化法、物理吸附法、絮凝沉淀法、肥水法和生物脱氮法，其中以生物脱氮费用最为低廉，并具有长效作用。生物脱氮主要是通过硝化和反硝化作用实现的。硝化过程中，以氨的氧化为起始，将氨氧化为亚硝酸盐，是硝化过程中的限速反应。环境中存在多种具有氨氧化能力的微生物，它们通常都为自养菌，广泛存在于不同的生态系统中，包括土壤、根际、淡水和废水处理系统[3-7]。

本研究从养殖池塘底泥中分离并鉴定具有氨氮去除能力的细菌，检测其对罗氏沼虾育苗废水的氨氮净化能力，为高密度集约化养殖模式中养殖水的净化寻找理想生物脱氮菌株提供指导。

1 材料与方法

1.1 培养基

1.2 好氧氨氧化菌的分离筛选

将采集的养殖鱼塘底泥以1 g∶100 mL的比例加入上述氨氧化菌富集培养基中振荡培养，温度28 ℃，转速180 r·min-1，每72 h将培养液以1∶100比例转接至新鲜氨氧化菌富集培养基中培养。转接3次后，取培养物于氨氧化菌纯化培养基平板上进行划线分离纯化，获得纯培养后，转入氨氧化菌液体培养基和营养肉汤中培养，并在新鲜培养液中加灭菌甘油至终浓度为20%后，于-80 ℃保存。

1.3 形态和生理生化特性

纯培养的细菌经28 ℃培养18～24 h后，作革兰氏染色，进行细菌形态观察。生理生化特性采用API 20E细菌鉴定系统进行测定，并依据检测结果，参考《常见细菌系统鉴定手册》[18]和《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[19]对菌株进行分类。抗菌药最小抑制浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)采用BD PhoenixTM-100药敏检测系统进行检测，根据NCCLS标准，判定药物敏感度。

1.4 16S rDNA序列和nirK基因测定

采用爱思进生物科技有限公司AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒抽提细菌基因组DNA，以此为模板进行16S rDNA靶标和nirK基因的扩增，16S rDNA靶标扩增引物采用通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(Escherichiacoli对应位置为8～27)和1541R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(E.coli对应位置为1 541～1 522)。PCR扩增程序:95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 40 s，33 个循环；72 ℃ 8 min。nirK基因引物根据NCBI中的nirK基因进行设计，NirK.F: 5′-CGTCTACCACTGCGCAC-3′；NirK.R: 5′-GCCTCGATCAGATTACGG-3′。PCR扩增程序为95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，33个循环；72 ℃ 8 min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，PCR产物测序和引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.5 序列分析

16S rDNA序列和NirK氨基酸序列通过NCBI的Blastn和Blastp检索系统分别进行序列同源性比对，并使用MEGA 7软件[20]与GenBank数据库中相近菌株相应序列进行多重序列比对分析，并以Neighbor-Joining法构建进化树[21]，分枝稳定性用Bootstrap分析[22]，重复1 000次。

1.6 不同条件下氨氮去除能力测定

罗氏沼虾育苗池废水用于氨氮去除能力的测试，育苗池废水初始水质NH4-N 8.6 mg·L-1、NO2-N 0.78 mg·L-1、TN 13.4 mg·L-1、COD 56 mg·L-1、pH 8.35。每500 mL三角瓶中装200 mL育苗废水，设置不同温度(25、30 ℃)和不同摇床转速(50、150 r·min-1)，共4组，分别为A(25 ℃、50 r·min-1)、B(25 ℃、150 r·min-1)、C(30 ℃、50 r·min-1)、D(30 ℃、150 r·min-1)。

菌株YX0703单菌落接种于营养肉汤过夜培养后，离心收集菌体并用PBS洗涤2次，并用PBS配制至终浓度为5.0×108cfu·mL-1。于试验初始，将新鲜配制的氨氧化菌YX0703接种上述摇瓶中，终浓度至2.4×105cfu·mL-1。在试验开始后，每12 h采集水样，连续取样至第96 h，水样经0.45 μm滤膜过滤后分别对NH4-N、NO2-N、TN、pH进行测定。NH4-N和NO2-N分别采用纳氏分光光度法和N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[23]，TN采用HACH公司的总氮测定试剂盒，pH采用上海雷磁精密酸度计PHS-3C进行测定。氨氮去除率=[(原始浓度-降解后浓度)/原始浓度]×100%。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征和生理生化特性

对养殖池塘底泥经过3次氨氮去除菌富集后，通过纯化分离获得1株氨氮去除菌YX0703。通过培养条件测试，发现该菌能在无机氮培养基(氨氧化菌富集培养基)和有机氮培养基(营养琼脂)上生长，表明该菌对生长营养来源适应能力强。在营养琼脂培养基上，菌落呈半透明浅灰白色，表面湿润光滑，微隆起，边缘整齐(图1)。经革兰氏染色，油镜下观察发现，菌株YX0703为两侧呈圆端的革兰氏阴性杆菌。

图1 菌落形态Fig.1 Colony morphology

API 20E系统生化鉴定结果表明，菌株YX0703为氧化酶阳性，葡萄糖氧化型，有运动性，可以将硝酸盐(NO3)还原为亚硝酸盐(NO2)，再将亚硝酸盐还原为氮气(N2)，表明该菌株具有好氧反硝化能力(表1)。参考标准菌株ATCC49188生化结果[24]以及《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》的描述，菌株YX0703鉴定为人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)。

通过BD PhoenixTM-100药敏检测系统对菌株YX0703的药物最小抑制浓度和耐药性进行检测，报告结果表明，菌株YX0703对β内酰胺类(碳青霉烯类除外)存在固有耐药，对多种头孢类药物耐药，但对喹诺酮类、美罗培南和四环素等抗菌药物敏感，具体见表2。

2.2 16S rDNA和nirK基因扩增

利用16S rDNA通用引物和设计的nirK引物，分别扩增获得1 536和537 bp的目的片段，对PCR产物电泳割胶纯化回收后，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定，测定的序列登陆GenBank，获得的登录号分别为FJ873801和GU207402。

表1 API 20E生化鉴定

Table 1 The results of biochemical experiment with API 20E

项目Items菌株StainsYX0703ATCC49188人苍白杆菌O.anthropi项目Items菌株StainsYX0703ATCC49188人苍白杆菌O.anthropiONPG+-15%GLU--1%ADH---MAN---LDC---INO---ODC---SOR---CIT-+30%RHA---H2S---SAC---URE++25%MEL---TDA--1%AMY---IND---ARA-+10%VP+-15%OX++90%GEL---NO2++42%MOB++99%N2++60%MaC++99%OF(O/F)OO47%

+，阳性；-，阴性；O，氧化。

+， Positive; -， Negative; O， Oxidation.

表2 药物敏感性结果

Table 2 The results of antibiotic sensitivities

抗生素AntibioticsMIC/(μg·mL-1)敏感度Sensitivity抗生素AntibioticsMIC/(μg·mL-1)敏感度Sensitivi-ty阿米卡星Amikacin≤8S粘菌素Colistin>2R阿莫西林-克拉维酸Amoxicillin-Clavu-lanate>16/8R庆大霉素Gentamicin≤2S氨苄西林Ampicillin>16R亚胺培南Imipenem≤1S氨苄西林-舒巴坦Ampicillin-Sulbactam>16/8R左氧氟沙星Levofloxacin≤1S氨曲南Aztreonam>16R美罗培南Meropenem≤1S头孢唑啉Cefazolin>16R莫西沙星Moxifloxacin≤1S头孢吡肟Cefepime>16R哌拉西林Piperacillin>64R头孢噻肟Cefotaxime>32R哌拉西林-他唑巴坦Piperacillin-Tazobactam>64/4R头孢他啶Ceftazidime>16R四环素Tetracycline≤2S氯霉素Chloramphenicol>16R甲氧苄啶-磺胺甲恶唑Trimethoprim-Sulfamethox-azole≤0.5/9.5S环丙沙星Ciprofloxacin≤0.5S

S，敏感；R，耐受。

S， Sensitive; R， Resistant.

2.3 16S rDNA序列和nirK基因序列的系统进化树

通过NCBI的Blastn检索系统进行基因序列同源性分析，16S rDNA序列同源性比对结果发现，YX0703株与人苍白杆菌同源性为100%。进化树分析发现，YX0703株与苍白杆菌属的7个种聚为1簇，进一步与人苍白杆菌(O.anthropi)、羽扇豆苍白杆菌(O.lupini)、中间苍白杆菌(O.intermedium)和金雀儿苍白杆菌(O.cytisi)聚为1小簇(图2)；此外，还可以看出，整个进化树将苍白杆菌属、布氏杆菌属(Brucellasp.)和枝动杆菌属(Mycoplanasp.)分为3簇，其中苍白杆菌属与布氏杆菌属进化关系较为接近，而具有固氮功能的慢生型大豆根瘤独立于以上3个属。生化检测、16S rDNA序列同源性分析和系统进化树结果表明，菌株YX0703分类地位为具有反硝化能力的人苍白杆菌。

在生化鉴定过程中发现菌株YX0703具有反硝化能力，因此，对亚硝酸盐还原酶基因nirK进行了检测和序列测定。获得的nirK序列同源性比对发现，菌株YX0703的nirK基因序列与人苍白杆菌(O.anthropi)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)和某些苍白杆菌属未定种的nirK基因同源性为100%。对选取的不同来源的35个NirK蛋白氨基酸序列构建的系统进化树结果显示，整个系统树被分为a、b、c、d 4个分支，菌株YX0703处于a分支下，与苍白杆菌属和粪产碱菌聚为1小簇(图3)。从整个进化树可以看出，苍白杆菌属、亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)和假单胞菌属(Pseudomonassp.)的NirK蛋白氨基酸序列在各自的属内较为保守，各自都处于单一的进化小分支内。然而，亚硝化螺菌(Nitrosospirasp.)、无色杆菌属(Achromobactersp.)和产碱菌属(Alcaligenessp.)的NirK蛋白氨基酸序列在属内具有多样性，不同的种被分在不同的进化分支，特别是产碱菌属中的粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)出现在了进化关系较远的a和c两个大进化分支中。

2.4 不同条件下氨氮去除能力测定

在设置的不同温度(25、30 ℃)和不同摇床转速(50、150 r·min-1)的4种废水处理组中，分别添加YX0703菌液至终浓度为2.4×105cfu·mL-1，进行氨氮去除能力测试。分时段采集水样，氨氮检测结果如图4所示，4个处理组氨氮随时间延长而逐渐降低，其中B组和D组降解速率高于A组和C组，B组和D组在第60 h时，氨氮浓度从0 h的8.6 mg·L-1分别降至0.26和0.22

括号内为基因序列GenBank登录号；分支点上的数字表示1 000次重复抽样所得该树的置信度；标尺长度表示每个位点发生0.01次置换；黑色方块表示菌株YX0703Numbers in parentheses represent the sequence accession numbers in GenBank. The numbers at the branch nodes represent the bootstrap confidence levels of the 1 000 bootstrap replications obtained. The scale bar indicates the number of substitutions per base is 0.01. The black square indicates strain YX0703图2 16S rDNA序列的系统进化树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic trees based on the 16S rDNA sequences

括号内为基因序列GenBank登录号；分支点上的数字表示1 000次重复抽样所得该树的置信度；标尺长度表示每个位点发生0.1次置换；黑色方块表示菌株YX0703Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank. The numbers at the branch nodes represent the bootstrap confidence levels of the 1 000 bootstrap replications obtained. The scale bar indicates the number of substitutions per base is 0.1. The black square indicates strain YX0703图3 NirK氨基酸序列的系统进化树Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic trees based on the deduced amino acid sequences of NirK

图4 不同组罗氏沼虾育苗废水中NH4-N浓度变化Fig.4 Changes of NH4-N concentration in M. rosenbergii hatching wastewater in different group

mg·L-1，氨氮去除率分别达到96.98%和97.44%。图5显示的是试验C组废水中NH4-N、NO2-N、TN和pH等指标的变化趋势。如图所示，C组NH4-N和TN逐渐降低，NO2-N先略微升高后降低，pH则先降后升，维持在7.2～8.5。4个处理组在84 h后均获得了良好的氮素污染物去除效果。

图5 罗氏沼虾育苗废水NH4-N、NO2-N、TN及pH变化(C组)Fig.5 Changes of NH4-N， NO2-N， TN concentrations and pH in M. rosenbergii hatching wastewater (group C)

3 结论与讨论

通过对YX0703的16S rDNA序列和进化树分析发现，苍白杆菌属进化关系与布氏杆菌属的细菌最为接近。在临床研究中也发现，人苍白杆菌在表型和遗传进化方面与布鲁氏菌密切相关[31]。也有研究学者采用API 20NE细菌鉴定系统将羊种布鲁氏菌错误地鉴定为人苍白杆菌[32]，将人苍白杆菌错误鉴定为皮氏罗尔斯顿菌[33]，表明人苍白杆菌与布鲁氏菌的生化特性比较接近，API 20NE不适合用于人苍白杆菌的鉴定。本研究采用了API 20E细菌鉴定系统，并未出现错误判别的现象，此外，采用了BD PhoenixTM-100细菌自动检测系统进行验证，45种生化结果也表明YX0703为人苍白杆菌，可信度值为99%(数据未给出)，也间接说明API 20E细菌鉴定系统应用于鉴定人苍白杆菌的合理性。

本研究主要是为了筛选具有高效除氮能力的细菌，用于水产养殖中养殖水和养殖废水的氨氮净化。湖州地区的罗氏沼虾育苗产业，经过10多年的发展，其育苗产量已占全国的60%以上。罗氏沼虾育苗过程中的种虾培育和幼体培养对水质都有很高的要求，特别是在幼体培养过程中，由于投入高营养的活性饵料和蛋羹，以及高密度的幼体培育，使得育苗水体水质不易控制。在YX0703氨氮去除能力检测过程中，我们选取适合筛选用于罗氏沼虾育苗用水净化的条件，降解温度选取25 ℃(种虾培育温度)和30 ℃(幼体孵化培养温度)，摇床转速选择了50 r·min-1(低氧条件)和150 r·min-1(高氧条件)，处理的水直接选取了水质较差的罗氏沼虾育苗废水。通过对YX0703氨氮去除能力检测发现，其在好氧条件下氨氮去除速率高于低氧条件，说明该菌的好氧反硝化能力在去氨氮过程中也起到了作用，在育苗废水氨氮去除过程中，YX0703首先将NH4-N氧化为NO2-N，再通过好氧反硝化作用将NO2-N还原为N2。在废水处理过程中，我们同时检测了育苗废水NH4-N、NO2-N、TN及pH的变化。NH4-N整体呈逐渐降低的过程，NO2-N则先升后降。脱氮过程中，pH先降低后升高，生物的硝化反应产生酸，而反硝化过程通常会产生碱度，2个过程在1个反应系统内进行，通过内部的循环维持酸碱度的平衡。整个过程中的pH变化，间接体现了菌株YX0703在脱氮过程中的氨氧化和反硝化特性。

此外，还对菌株YX0703的抗菌药物敏感性进行了检测，其对β内酰胺类和头孢类抗生素表现出了较强的耐药性，可能跟携带AmpC酶有关[34]，而对喹诺酮类、美罗培南、庆大霉素和四环素等抗菌药物较为敏感，该结果与刘志国等[35]综述的人苍白杆菌耐药性基本一致。不同分离株表现出的药物敏感度如此相似，说明人苍白杆菌基因组中控制药物降解和外排的基因或是药物作用靶点在进化过程中表现比较保守。这给我们采用氨氧化菌YX0703作为养殖用水水质改良剂提供了很好的用药指导意义。当使用了氨氧化菌YX0703的养殖或育苗水体出现鱼类或是虾类疾病时，在疾病治疗过程中，可以选取病原敏感，而氨氧化菌YX0703耐受的药物用作疾病防治。

综上所述，本研究分离获得的菌株YX0703能在无机氮条件和有机氮条件下生长，并具有氨氧化活性和反硝化活性。该菌株可用于罗氏沼虾育苗或养殖废水的氨氮净化，60 h氨氮去除率达到97.44%。菌株YX0703的氨氧化和反硝化机制有待进一步深入研究。

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(责任编辑侯春晓)

Isolation， identification of an ammonia-oxidizing bacteria and its application in treatment of wastewater from breeding ofMacrobrachiumrosenbergii

PAN Xiaoyi， LIN Lingyun， YIN Wenlin， XU Yang， YAO Jiayun， YUAN Xuemei， ZHENG Qunyan， SHEN Jinyu*

(ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries，AgricultureMinistryKeyLaboratoryofHealthyFreshwaterAquaculture，Huzhou313001，China)