红豆越橘中总黄酮的提取及抑菌性质研究

李煜，韩春然，黄赫雁，戴传荣，张家成，林枞雨

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

红豆越橘中总黄酮的提取及抑菌性质研究

李煜，韩春然*，黄赫雁，戴传荣，张家成，林枞雨

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

研究超声波辅助提取红豆越橘总黄酮的工艺及其抑菌作用。以超声波功率，料液比，溶剂浓度和提取时间为考察因素，以总黄酮提取率为指标，采用正交试验优化最佳提取工艺，并对其总黄酮提取液的抑菌效果进行系统研究。红豆越橘中总黄酮提取的最佳条件为，超声波功率为450 W、超声时间为25 min、乙醇浓度为50%、料液比为1∶15（g/mL），总黄酮的提取率为29.87 mg/g。抑菌试验表明，红豆越橘总黄酮提取液（pH 2.8）的浓度为40 mg/mL时，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色葡萄球菌具有明显的抑菌作用，抑菌圈直径分别为21.17、21.67、23.91 mm；最低抑菌浓度分别为：2.5、2.5、1.25 mg/mL；红豆越橘的低pH值对总黄酮提取液的抑菌效果具有一定贡献，中和后的红豆越橘总黄酮提取液对各菌株的抑制能力显著下降。红豆越橘中总黄酮提取率可达29.87 mg/g，在酸性条件下，对枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显抑制作用。

红豆越橘；超声波提取；总黄酮；抑菌

红豆越橘（Vaccinium Vitis-idaea L.）是一种营养价值很高的天然野生浆果，属于杜鹃花科植物，多年生落叶灌木，果实为亮红色，风味酸涩[1]。红豆越橘中含有很多种化学活性成分，EK[2]从中分离出28种酚类化合物，而黄酮类化合物是其最重要的生物活性成分。并且黄酮类化合物具有低毒和广谱的药理活性，在治疗心血管疾病、抗肿瘤抗癌、抗氧化清除自由基、抗炎等方面均有突出表现[3-7]，许多研究表明，黄酮类化合物具有直接抑菌[8]、协同抑菌及抑制细菌毒性等作用[9]。由于越橘本身含有丰富的有机酸[10]，而有机酸的抑菌作用是众所周知的，目前对越橘黄酮抑菌作用的报道普遍没有排除酸度对其抑菌能力的影响，因此，越橘中黄酮的抑菌能力并不是非常明确，本试验以超声辅助波提取红豆越橘总黄酮，并系统研究该总黄酮对大肠杆菌，枯草杆菌和白色葡萄球菌的抑制效果，明确越橘黄酮的抑菌能力，为红豆越橘的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红豆越橘：大兴安岭百盛科技开发有限公司。

芦丁标准品：北京红星化工厂；无水乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化钠、葡萄糖、琼脂、牛肉膏和蛋白胨均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

R-205旋转蒸发仪：上海申胜生物技术有限公司；ZHWY-2102C恒温摇床培养箱：上海智城分析仪器公司；手提式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；722型光栅分光光度计：上海光谱仪有限公司；SWCJ-1D无菌操作台：苏州净化设备厂；ESJ180-4电子天平：上海光正医疗仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

取适量红豆越橘冻果解冻，然后放入匀浆机中充分搅碎，备用。

1.3.2 标准曲线制作

根据周慧恒[11]等的方法，以芦丁质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，得出回归方程y=0.197 9x-0.002 1，R2=0.990 1。

1.3.3 单因素试验设计

1.3.3.1 超声功率对红豆越橘总黄酮提取率的影响

按照液料比1∶10（g/mL）称取原料与60%乙醇溶液，分别在 250、300、350、400、450、500 W 功率下超声提取25 min，进行3次平行试验，计算提取率。

1.3.3.2 超声时间对红豆越橘总黄酮提取率的影响

按照液料比1∶10（g/mL）称取原料与60%乙醇溶液，分别用 400 W 的超声波处理 10、15、20、25、30、35 min，进行3次平行试验，计算提取率。

1.3.3.3 乙醇浓度对红豆越橘总黄酮提取率的影响

按照液料比1∶10（g/mL）分别称取原料与30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，搅拌均匀，分别用400 W的超声波处理25 min，进行3次平行试验，计算提取率。

1.3.3.4 料液比对红豆越橘总黄酮提取率的影响

按照料液比为 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）称取原料和60%乙醇溶液，然后用400 W的超声波处理25 min，进行3次平行试验，计算提取率。

1.3.4 总黄酮提取率的测定

按照1.3.2的方法测定波长510 nm处的吸光度。根据回归方程式，求出相当于样品吸光度的总黄酮含量，按下式[12]求出总黄酮提取率。

式中：V为提取液定容体积，mL；m为红豆越橘质量，g。

1.3.5 正交试验

在单因素试验基础上，以超声波功率（A）、超声提取时间（B）、乙醇浓度（C）和料液比（D）为因素，以红豆越橘总黄酮提取率为指标，利用L9（34）正交试验表进行正交试验，确定红豆越橘总黄酮提取的最佳工艺。正交试验的因素水平表如表1。

表1 红豆越橘总黄酮提取工艺正交试验因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for the extraction of total flavonoids from lingonberry

1.3.6 抑菌试验

1.3.6.1 红豆越橘总黄酮供试液的制备

按照最佳工艺进行超声波辅助红豆越橘总黄酮提取，并配置成浓度为40 mg/mL的供试液。

1.3.6.2 菌种的活化及菌悬液制备

参照付振喜[13]的方法进行菌种的活化，使菌悬液浓度约在106CFU/mL～107CFU/mL，备用。

1.3.6.3 红豆越橘总黄酮提取液抑菌活性的研究

采用滤纸片法[14]。以30%的乙醇（F）、柠檬酸缓冲溶液（pH=2.8，G）和 pH 2.8的30%乙醇溶液（H）分别作对照。置于37℃培养箱中培养24 h后，测量抑菌圈直径大小，取其平均值作为试验结果。

1.3.6.4 红豆越橘总黄酮提取液最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用对倍稀释法[15]，将总黄酮浓缩液（E）用无菌蒸馏水进行对倍稀释，配制成浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25 mg/mL的稀释液。用无菌吸管分别吸取1 mL稀释液加入到无菌培养皿中，然后向每培养皿倒入19 mL培养基，充分混匀，静置凝固后，制成含样品平板。另取一组培养皿，操作同上，用30%的乙醇（F）、柠檬酸缓冲溶液（pH=2.8，G）和pH 2.8的30%乙醇溶液（H）取代稀释液配做为对比组。并在上述各平板内加入0.1 mL菌悬液，用无菌涂棒涂布均匀，置37℃条件下培养24 h后，观察菌的生长情况。以完全没有菌落生长的提取物浓度为该提取物的最低抑菌浓度。每个浓度及对照组均设3个重复。

1.3.6.5 红豆越橘总黄酮提取液中和后的MIC的测定

参照Gündüz[16]的研究，用氢氧化钠溶液调节红豆越橘总黄酮供试液使其pH值为7.0，旋转蒸发成浸膏状，用 30%乙醇配制成浓度 600、500、400、300、200 mg/mL的供试液备用，并以30%的乙醇做为对比组，按照1.3.6.4的操作，以完全没有菌落生长的提取物浓度为该提取物的最低抑菌浓度。每个浓度及对照组均设3个重复。

1.3.7 数据分析

数据以SPSS10.0进行分析。所有试验均重复3次进行，采用单向方差分析（Tukey法）比较数据间的差异性，显著水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声波功率对总黄酮提取率的影响

超声波功率对总黄酮提取率的影响见图1。

图1 超声功率对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic action power on the extraction rate of total flavonoids

由图1可知，当超声功率在250 W～400 W之间时，红豆越橘总黄酮含量呈现增长趋势。当超声波功率为400 W时，总黄酮提取率显著（P＜0.05）高于其它功率组，达到29.11 mg/g，显著高于其它功率组。当超声功率继续增加时，总黄酮的提取率反而缓慢下降，这可能是由于较大功率的超声波会破坏黄酮类化合物的分子结构[17]，而且较大功率的超声波会产生过多的热量，这也会破坏物质结构，进而导致提取率降低。

2.1.2 超声处理时间对总黄酮提取率的影响

超声处理时间对总黄酮提取率的影响见图2。

图2 超声处理时间对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

由图2可知，超声处理时间在10 min～35 min之间，红豆越橘总黄酮提取率随着超声时间呈现先增加后降低的趋势。当超声处理时间为25 min时，总黄酮提取率最高显著（P＜0.05）高于其它组达到28.97 mg/g。超声处理时间在25 min～35 min之间时，总黄酮的提取率随时间的延长而增加，随后总黄酮提取率呈现下降趋势。

2.1.3 乙醇浓度对红豆越橘总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对总黄酮提取率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of alcohol concentration on the extraction rate of total flavonoids

由图3可知，乙醇浓度在30%～80%之间红豆越橘总黄酮提取率随着乙醇浓度呈现先增加后下降的趋势。当乙醇浓度达到50%时提取率最高，显著（P＜0.05）高于其它组，达到29.38mg/g。当乙醇浓度超过50%时，提取率反而下降，这是因为当乙醇浓度增加时，某些杂质溶出也增多，因而会降低总黄酮的提取率。

2.1.4 料液比对红豆越橘总黄酮提取率的影响

料液比对总黄酮提取率的影响见图4。

由图 4可知，在料液比为 1∶5（g/mL）到 1∶20（g/mL）之间，红豆越橘总黄酮提取率呈现急剧增长趋势，且各组提取率存在显著性差异。当料液比为1∶20（g/mL）时，总黄酮提取率（29.52 mg/g）最高，显著高于其它组，这可能是由于提取溶剂较多，超声波难于作用到物料本身上，黄酮类化合物溶出速度减慢，考虑生产的成本，料液比不宜太大。

图4 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2 正交试验结果

正交试验结果及分析如表2所示。

表2 超声波法提取总黄酮的正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

由正交试验分析处理结果如表2所示，结合K值的分析可以得出优化方案为：时间25 min，超声波功率450 W，料液比 1∶15（g/mL），乙醇浓度 50%。在正交试验的4个因素中，由R值的大小分析比较可以得出来，影响提取率的因素依次为：料液比>功率>时间>乙醇浓度，由于D1A3B2C2不在以上9个正交试验中，进而验证试验，在最优条件下进行3次平行试验，从而得到红豆越橘中总黄酮的提取率为29.87 mg/g。

2.3 抑菌试验结果

2.3.1 红豆越橘总黄酮抑菌活性的研究

红豆越橘总黄酮抑菌活性的研究结果见表3。

由于红豆越橘总黄酮浓缩液其本身具有的低pH值和其溶剂中的乙醇存在一定的抑菌能力，此处试验与崔玮[12]、黎继烈[18]等的研究相比，添加了与总黄酮提取液pH值相同的柠檬酸缓冲溶液、30%乙醇溶液和乙醇溶液（30%，pH2.8）3组对照试验，进一步明确红豆越橘中总黄酮的抑菌能力。

表3 红豆越橘总黄酮抑菌活性Table 3 Inhibitory activity of total flavonoids from lingonberry mm

结果如表3所示，乙醇溶液（30%）无抑制作用。柠檬酸缓冲溶液（pH 2.8）与乙醇溶液（30%、pH2.8）对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白葡萄球菌均有一定抑菌能力，并且抑菌能力随稀释梯度增加而降低，乙醇溶液（30%，pH2.8）的抑菌能力略强于柠檬酸缓冲溶液（pH 2.8）。

红豆越橘中总黄酮提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白葡萄球菌均有抑制作用。并且总黄酮提取液与各对照组对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白葡萄球菌的抑菌圈直径之间存在显著（P<0.05）差异。此时总黄酮提取液的浓度为40 mg/mL，抑菌圈直径均大于21 mm。尤其是对于枯草芽孢杆菌和白色葡萄球菌最为敏感，抑菌圈分别为21.67 mm和23.91 mm，并且均大于大肠杆菌的抑菌圈（21.17 mm）。

与红豆越橘总黄酮提取液相比，柠檬酸缓冲溶液（pH 2.8）与乙醇溶液（30%，pH 2.8）的抑菌能力较低。这说明红豆越橘总黄酮浓缩液对供试菌种的抑制作用不仅是由于其本身浓缩液的低pH值和溶剂中的乙醇所引起的，进一步说明了红豆越橘中黄酮类化合物具有一定的抑菌能力。

2.3.2 红豆越橘总黄酮提取液最低抑菌浓度的测定

红豆越橘总黄酮提取液最低抑菌浓度的测定结果见表4。

表4 红豆越橘总黄酮的最低抑菌浓度（pH2.8）Table 4 Minimum inhibitory concentration of total flavonoids from lingonberry（pH2.8）

续表4 红豆越橘总黄酮的最低抑菌浓度（pH2.8）Continue table 4 Minimum inhibitory concentration of total flavonoids from lingonberry（pH2.8）

结果如表4所示：随着红豆越橘总黄酮浓缩液浓度的降低，抑菌能力也随之降低，红豆越橘总黄酮提取液对各菌株的最低抑菌浓度分别为：大肠杆菌2.5 mg/mL、枯草芽孢杆菌2.5 mg/mL、白葡萄球菌1.25 mg/mL。乙醇溶液（30%）无明显抑菌能力，乙醇溶液（30%，pH=2.8）的抑制作用比柠檬酸缓冲溶液（pH 2.8）略强。红豆越橘总黄酮提取液（pH 2.8）抑菌作用大小依次为：白色葡萄球菌大于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌，这与滤纸法检测结果基本一致。

2.3.3 红豆越橘总黄酮提取液中和后的最低抑菌浓度的测定

红豆越橘总黄酮提取液中和后的最低抑菌浓度的测定结果见表5。

表5 红豆越橘总黄酮提取液中和后的最低抑菌浓度Table 5 Minimum inhibitory concentration of total flavonoids from Lingonberry（pH7.0）

如表5所示，随着红豆越橘总黄酮提取液（pH7.0）的浓度降低，抑菌能力也随之降低，红豆越橘总黄酮提取液（pH7.0）对各菌株的最低抑菌浓度分别为：大肠杆菌400 mg/mL、枯草芽孢杆菌600 mg/mL、白葡萄球菌500 mg/mL。红豆越橘总黄酮提取液（pH7.0）抑菌作用大小依次为：大肠杆菌＞白色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌。这与2.3.2中的结果，以及很多未探究酸性影响的研究[18-21]相比，中和后的红豆越橘总黄酮提取液的最低抑菌浓度较大。这说明，在中性条件下，红豆越橘中的总黄酮抑菌能力较低，进一步说明了红豆越橘中的黄酮类化合物与低pH值复合时抑菌能力更强。

3 结论

超声波辅助提取技术具有较高的提取效率、节约能源以等优势[22-23]。本研究通过单因素考察及正交试验设计，得到红豆越橘总黄酮最优提取工艺为：超声波功率为450 W、超声时间为25 min、乙醇浓度为50%、料液比为1∶15（g/mL）。在次条件下对红豆越橘中总黄酮进行提取，最终提取率为29.87 mg/g。

红豆越橘总黄酮对枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑菌作用，对菌株的抑制作用随着浓度的增加而增强，尤其是对白色葡萄球菌的最大抑菌圈直径可达23.91 mm，枯草芽孢杆菌21.67 mm，大肠杆菌21.17 mm。同时经测定，红豆越橘总黄酮提取液（pH2.8）对各菌株的最低抑菌浓度分别为：大肠杆菌2.5 mg/mL、枯草芽孢杆菌2.5 mg/mL、白葡萄球菌1.25 mg/mL，中和后的红豆越橘总黄酮提取液对各菌株的最低抑菌浓度分别为：大肠杆菌400 mg/mL、枯草芽孢杆菌600 mg/mL、白葡萄球菌500 mg/mL。这说明红豆越橘的低pH值对总黄酮提取液的抑菌效果具有一定贡献，中和后的红豆越橘总黄酮提取液对各菌株的抑制能力显著下降。本试验结果可为红豆越橘总黄酮提取工艺的确定及在抑菌方面的应用提供理论参考。

[1] 关丽华,王秀华.红豆越橘中化学成分的研究进展[J].北方园艺,2007(4):81-83

[2] Ek S,Kartimo H,Mattila S,et al.Characterization of phenolic compounds from lingonberry(Vaccinium vitis-idaea).[J].Journal of A－gricultural&Food Chemistry,2006,54(26):9834-9842

[3] 姜帅,张权,李旻辉,等.红豆越橘的研究进展[J].包头医学院学报,2015,31(9):130-133

[4] 王宇希.丁香叶总黄酮的提取工艺及抑菌效果评价[D].沈阳:东北农业大学,2013

[5] 刘平.玉米须黄酮的提取分离及生物活性研究[D].西安:陕西师范大学,2006

[6] 陈丛瑾,王琪,李欣.黄酮类化合物抗氧化和抑菌生物活性研究进展[J].中国药房,2011(35):3346-3348

[7] Zhao F P,Strack D,Baumert A,et al.Antioxidant flavonoids from leaves of Polygonum hydropiper,L.[J].Phytochemistry,2003,62(2):219-228

[8] Sathiamoorthy B,Gupta P,Kumar M,et al.New antifungal flavonoid glycoside from Vitex negundo.[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2007,17(1):239-42

[9] 游庭活,刘凡,温露,等.黄酮类化合物抑菌作用研究进展[J].中国中药杂志,2013,38(21):3645-3650

[10]杨华,刘亚娜,郭德军.红豆越橘功能性成分的研究进展[J].安徽农业科学,2014(35):12637-12639

[11]周慧恒,杨胜敖,欧阳吉德,等.蓝莓黄酮浸提工艺研究[J].食品与发酵科技,2014(1):68-71

[12]崔玮,李玉兰,杨爱梅.超声辅助提取甘青虎耳草总黄酮工艺及其抑菌作用[J].食品科学,2012(12):108-113

[13]付振喜.丁香等天然物质的抑菌成分在果蔬保鲜中的应用研究[D].天津:天津科技大学,2010

[14]张佳,王莹,张峰,等.滤纸片法测定黄花蒿提取物对霉菌的抑制活性[J].湖北农业科学,2009,48(5):1153-1154

[15]胡筱.蓝莓叶提取液的抑菌作用及其在鲜切竹笋中的应用研究[D].南京:南京师范大学,2012

[16]Gündüz G T.Antimicrobial activity of sloe berry purees on Salmonella spp.[J].Food Control,2013,32(2):354-358

[17]宋国胜,胡松青,李琳.超声波技术在食品科学中的应用与研究[J].现代食品科技,2008,24(6):609-612

[18]黎继烈,张慧,王卫,等.金橘黄酮抑菌作用研究[J].食品与机械,2008,24(5):38-41

[19]谷肄静,王立娟.蒲公英总黄酮的提取及其抑菌性能[J].东北林业大学学报,2007,35(8):43-45

[20]丁存宝,刘海燕,李桂秋,等.月季果黄酮的提取及抑菌作用研究[J].食品工业,2012(1):113-116

[21]朱会霞.覆盆子黄酮的抑菌特性研究[J].现代食品科技,2012(11):1484-1487

[22]廖维良,赵美顺,杨红.超声波辅助提取技术研究进展[J].广东药学院学报,2012(3):347-350

[23]韩伟,叶亚婧,雷祖海,等.超声波在活性成分提取中的应用进展[J].现代制造,2011(20):33-38

Optimization of Extraction Process of Total Flaonoids from Lingonberry and Evaluation of Its Antibacterial Activities

LI Yu，HAN Chun-ran*，HUANG He-yan，DAI Chuan-rong，ZHANG Jia-cheng，LIN Cong-yu
（School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，Heilongjiang，China）

To investigate ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from lingonberry and its antibacterial activities.Using ultrasonic power，extraction time，solvent concentration and extraction time as factors，extraction yield of total flavonoids as indicator to optimize the extraction conditions of the total flavonoids from blueberry by orthogonal experiment，the antibacterial activity of flavonoids was investigated systematically.The optimal extraction conditions of total flavonoids of lingonberry were as follows：ultrasonic power 450 W，ultrasonic time 25 min，ethanol concentration 50%，solid-liquid ratio 1 ∶15 （g/mL），under above conditions，total flavonoids extraction rate was 29.87 mg/g.When the concentration（pH 2.8）of total flavonoids from lingonberry was 40 mg/mL，it had obvious antibacterial effect on Escherichia coli，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus with the inhibition zone diameter of 21.17，26.67，23.91 mm respectively.The minimum inhibitory concentrations（MIC）were 2.5，2.5，1.25 mg/mL respectively.The low pH of the total flavonoids contributed to some extend to the antibacterial activity of the flavonoids，after neutralization，the antibacterial activity decreased significantly.The yield of flavonoids from lingonberry was 29.87 mg/g，under acidic conditions，the flavonoids had significant effect on Escherichia coli，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

lingonberry；ultrasonic extraction；total flavonoids；antibacterial

2016-09-20

李煜（1990—），女（汉），研究生，研究方向：农产品加工利用。

*通信作者：韩春然（1970—），女，教授，博士，研究方向：果蔬贮藏与加工。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.015