胡椒黄酮的提取及其抗氧化性研究

赵丹丹，陈盛余，凌绍明，谢瑜，曾小月

（广西高校桂西生态环境分析和污染控制重点实验室，百色学院，广西百色533000）

胡椒黄酮的提取及其抗氧化性研究

赵丹丹，陈盛余*，凌绍明，谢瑜，曾小月

（广西高校桂西生态环境分析和污染控制重点实验室，百色学院，广西百色533000）

研究胡椒中黄酮类化合物的提取工艺及其抗氧化性。分别考察单因素料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间的影响，并在单因素基础上进行四因素三水平正交设计试验。结果表明，胡椒黄酮的最佳提取工艺为料液比为1∶35（g/mL），乙醇浓度为80%，提取温度75℃，提取时间为2 h。在最佳条件下，胡椒黄酮的提取率达到3.68%；胡椒黄酮是一种有效的自由基清除剂，对DPPH·有显著的清除作用。在试验浓度范围内，清除率随浓度增大而增大，最高可达98.7%。

胡椒；黄酮；提取；抗氧化性

胡椒是常见的调味品之一，在日常生活中被广泛使用[1]。研究表明，胡椒除了可以作为香料使用之外还具有良好的药用功效[2]，比如抗氧化、降血脂、消炎等作用[3-5]。胡椒的药用功效主要是因为其含有多种活性成分[2，6]，因此提取胡椒活性成分对胡椒的开发利用具有重要意义。

目前已经有学者对提取胡椒活性成分进行了研究。比如侯文洁[7]以甲醇做溶剂并采用传统回流法从胡椒中提取胡椒碱，并优化了提取工艺。除了生物碱，胡椒中还含有黄酮类物质[6，8]，而有关胡椒黄酮的提取工艺研究报道并不多，因此本研究采用正交试验法对胡椒黄酮的提取工艺进行系统研究，考察工艺参数与黄酮提取量的相关性。而不同条件下得到的黄酮化合物的具体药用功效是不一样的，鉴于此研究还对胡椒黄酮提取物清除DPPH自由基的作用进行了初步研究，以期进一步掌握胡椒黄酮的抗氧化作用，为胡椒的综合利用提供更多科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

芦丁对照品：上海雅吉生物科技有限公司；白胡椒：百色市右江区金三角市场；DPPH试剂：国药集团化学试剂有限公司；硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等分析纯；试验用水为一次蒸馏水。

1.1.2 仪器

BSA224S型分析天平：赛多利斯公司；DF-2数显集热式磁力搅拌器：金坛市精达仪器制造有限公司；SHZ-D型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；800型离心沉淀机：上海手术器械十厂；UV-2700型紫外可见分光光度计：日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制

精密称取2.5 mg芦丁用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中。精密吸取 0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL至于6个10 mL容量瓶中，分别加入5%NaNO2溶液0.5 mL，摇匀静置5 min，分别加入10%Al（NO3）3溶液0.5mL，摇匀静置5min，分别加入4%NaOH溶液2mL，摇匀静止15 min分别测定510 nm的吸光度[9]。以芦丁浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标Y，求得线性回归方程为 Y=0.067 1 X+0.005，r=0.999 3。

1.2.2 样品液制备

称取5.00 g胡椒，按比例加入一定量的乙醇溶液浸泡12 h，在一定温度下回流提取一定时间，抽滤，浓缩，再用乙醇定容为50 mL。取定容好的提取液1.00mL，按照“1.2.1标准曲线绘制”的方法测定吸光度并计算黄酮提取率。

提取率/%=（样品液总黄酮量/胡椒样品量）×100

1.2.3 胡椒黄酮对DPPH自由基的清除作用[10]

将最优条件下的胡椒黄酮提取液用旋转蒸发仪浓缩、真空干燥后用无水乙醇配制成不同浓度的黄酮提取物溶液。称取DPPH试剂5.0 mg，用无水乙醇定容在250mL容量瓶中备用。在不同具塞试管中加入2mL DPPH溶液，并分别加入不同浓度的黄酮提取液2 mL，摇匀，待30 min后测定517 nm的吸光度As；用2 mL DPPH与2 mL乙醇做对照试验，测得其吸光度Ar；用2 mL样品液与2 mL溶剂混合后测定其吸光度A0。计算DPPH自由基的清除率（Y），计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 料液比的影响

在乙醇浓度为95%，提取温度为80℃，提取时间为3 h条件下，分别试验不同料液比对黄酮提取率的影响结果见图1。

图1 料液比的影响Fig.1 The effects of solid-to-liquid ratio

由图1可知，当溶剂用量增多时，总黄酮提取率增加，在料液比 1 ∶10（g/mL）变化到 1 ∶30（g/mL）时，黄酮提取率增加比较明显；当料液比从1∶30（g/mL）变化到1∶50（g/mL）时总黄酮提取率虽然有增加，但是增加的量很有限。这说明胡椒黄酮在乙醇溶液的溶解度是有一定限度的，需要一定量的溶剂才能将大部分黄酮溶出。从经济角度出发选择1∶30（g/mL）的料液比比较合适。

2.2 乙醇浓度的影响

在料液比为 1∶30（g/mL），提取温度为 80℃，提取时间为3 h条件下，分别试验不同浓度乙醇对黄酮提取率的影响结果见图2。

当乙醇浓度增大时，黄酮提取率先增大后减小，乙醇浓度增大溶剂的极性会下降，因此，胡椒中的极性黄酮物质的溶出量会下降，但是弱极性黄酮的溶解度会增加。这两者对总黄酮的提取率影响是一个矛盾关系，在这两者之间选取一个合适的乙醇浓度可以使极性黄酮和弱极性黄酮都有一个合适的溶解度，并使总黄酮的溶解度有最大值。在图2中可以看出，选择80%的乙醇对总黄酮提取率较好。

图2 乙醇浓度的影响Fig.2 The effects of ethanol concentration

2.3 提取温度的影响

在料液比为1∶30（g/mL），乙醇浓度为80%，提取时间为3 h条件下，分别试验不同温度对黄酮提取率的影响结果见图3。

图3 温度的影响Fig.3 The effects of extraction temperature

由图3可知，在70℃之前，黄酮提取率随温度升高而增大，温度超过70℃之后随温度升高而降低。这是由于在70℃之前，黄酮随着温度的升高溶解度增大，加热有利于进一步促使黄酮溶出；而当温度大于70℃之后，由于温度过高可能会促使部分黄酮分解，或者发生其它反应，所以图3曲线在70℃之后会呈现下降趋势，并且温度越高，提取率下降越明显。为了使胡椒黄酮的提取达到较好效果，选择70℃的提取温度。

2.4 提取时间的影响

在料液比为 1 ∶30（g/mL），乙醇浓度为 80%，提取温度为70℃的条件下，分别试验不同提取时间对黄酮提取率的影响结果见图4。

图4 时间的影响Fig.4 The effects of extraction time

由图4可以知，提取时间为2 h，黄酮提取率有最大值。当时间小于2 h，加热时间的延长可以促进黄酮类物质从胡椒中溶解出来；当加热时间大于2 h时，黄酮物质可能会在长时间加热条件下发生分解反应，所以图4的提取率曲线在2 h后出现下降趋势。从提取率出发，选择2 h的提取时间比较合适。

2.5 正交试验

在单因素基础上，选择料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间4个因素设计L9（34）正交试验，因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levers of orthogonal tests

表2L9（34）正交试验设计和结果Table 2L9（34）Orthogonal experimental design and results

由表2的结果可以知道RC>RD>RB>RA，所以各因素对黄酮提取率的影响大小顺序为提取温度>提取时间>乙醇浓度>料液比。由均值K大小对比可以知道，最佳提取工艺为A3B2C3D2，即料液比为1∶35（g/mL），乙醇浓度为80%，提取温度75℃，提取时间为2 h。

2.6 正交结果验证

选择正交试验优化的工艺进行提取，平行测定5份，得到该工艺下的黄酮平均提取率为3.68%，该结果明显比前面的提取率高，说明该优化工艺是最优工艺。

2.7 不同浓度胡椒黄酮对DPPH·的清除作用

不同浓度胡椒黄酮对DPPH·的清除作用见图5。

图5 不同浓度胡椒黄酮对DPPH·的清除作用Fig.5 The scavenging effect of different concentrations of pepper flavonoids on DPPH·

胡椒黄酮提取液对DPPH自由基的清除率越大，其抗氧化活性就越强，反之就越弱[10]。由图5可知，不同浓度的胡椒黄酮对DPPH·的清除作用并不相同，当胡椒黄酮浓度增大其对DPPH·的清除率增大，黄酮浓度为60 μg/mL时，其对DPPH·的清除率达到98.7%。这说明胡椒黄酮具有抗氧化性，其抗氧化性随着浓度增大而增强，这与金莲花[11]、木瓜[12]相似。

3 结论与讨论

试验得到提取胡椒黄酮的最佳工艺条件为料液比为1∶35（g/mL），乙醇浓度为80%，提取温度75℃，提取时间为2 h，在该工艺条件下，胡椒黄酮的提取率达到3.68%。试验采用乙醇溶液作为溶剂主要是因为黄酮类化合物易溶于乙醇溶液；黄酮的提取率收多种因素的影响，因此试验选择了4个主要因素进行研究，各因素之间还存在一定的相互作用，所以在单因素基础上增加了正交设计试验进行优化，优化的结果表明了正交试验的工艺更加适合提取胡椒黄酮。各种植物提取的黄酮物质都有一定区别，因此对胡椒黄酮提取物清除DPPH·作用进行研究可以考察其抗氧化能力。研究结果表明胡椒黄酮对DPPH·具有一定的清除作用，在黄酮浓度10 μg/mL～60 μg/mL范围内，其清除DPPH·作用随浓度的增大而增强。这也说明在该浓度范围内其抗氧化作用也是如此，这也证明胡椒黄酮具有潜在的药用价值，但是目前还很少对胡椒黄酮的进行实际开发利用。因此本研究得到的提取方法有望应用于胡椒黄酮的提取，并进一步推动胡椒的开发利用。

[1] 龙宇宙.热带特色香辛饮料作物农产品加工与利用[M].海口:海南出版社,2007:63-113

[2] 林通国.中药学[M].长沙:湖南科学技术出版社,1984:162-163

[3] Sunila E S,Kuttan G.Immunomodulatory and antitumor activity of Piper Iongumlinn.andpiperine[J].J Ethnopharmacol,2004,90(2/3):339

[4] Dogra R K,Khanna S,Shanker R.Immunctoxicological effects of piperine in mice[J].Toxicology,2004,196(3):229-236

[5] Wang Q Q,Lai L H,Fu Q H,et al.Piperine suppresses tumor growth and metastasis in vitro and in vivo in a 4T1 murine breast cancer model[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(4):523

[6] 杨柳,王雪,王佳,等.白胡椒化学成分研究[J].天津医科大学学报,2016,22(4):300-301

[7] 侯文洁,张卫刚,薛文娇.胡椒中胡椒碱的提取工艺研究[J].中国调味品,2008(5):55-58

[8] 张水平,谷风林,吴桂苹,等.胡椒果与胡椒叶精油化学成分分析[J].热带作物学报,2014,35(2):387-395

[9] 杨静毅,喻玲玲,吴梅,等.银合欢果皮总黄酮含量测定及抗氧化活性[J].食品科学,2015,36(8):187-190

[10]李鹏婧,柳旭光,龙海荣,等.超声波辅助提取菱角壳总黄酮及抗氧化性研究[J].食品科技,2011,36(1):167-171

[11]唐津忠,鲁晓翔,陈瑞芳.金莲花中黄酮类化合物的提取及其抗氧化性研究[J].食品科学,2003,24(6):88-91

[12]周晓丽,邵震,李婷婷,等.木瓜黄酮的提取及抗氧化性研究[J].食品工业科技,2007,28(8):170-172

Extraction and Anti-oxidation Property of Flavones from Peppers

ZHAO Dan-dan，CHEN Sheng-yu*，LING Shao-ming，XIE Yu，ZENG Xiao-yue
（Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Regional Ecological Environment Analysis and Pollution Control of West Guangxi，Baise University，Baise 533000，Guangxi，China）

The extraction of flavonoids from peppers was studied and the antioxidant activity of the extract was evaluated as well.The effects such as solid-to-liquid ratio，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time were investigated respectively.Based on single-factor experiments，orthogonal experiment of four factors and three levels were studied.The results showed that optimum extraction process were solid-to-liquid ratio of 1 ∶35（g/mL），ethanol concentration of 80%，extraction temperature of 75 ℃ and extraction time of 2 hours.The extraction rate of flavonoids could reach 3.68%under the optimum conditions.The flavonoids from peppers was a kind of effective free radical scavenger which had significant scavenging effect on DPPH·.The elimination rate rose with the increasing flavonoids concentration.It could reach the highest value of 98.7%.

peppers；flavonoids；extraction；anti-oxidation

2016-10-09

广西大学生创新训练项目（201610609057）；百色学院校级科学研究项目基金资助（2015KBN06）；百色学院校级大学生创新训练项目（201610609118）

赵丹丹（1985—），女（汉），讲师，硕士，从事药物分析和电分析化学研究。

*通信作者：陈盛余（1984—），讲师。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.013