丹酚酸B对肾间质纤维化大鼠的肾保护作用及其机制

蔡洲，李道，吴际，吴琼，梅燕

(武汉科技大学城市学院，武汉430083)

丹酚酸B对肾间质纤维化大鼠的肾保护作用及其机制

蔡洲，李道，吴际，吴琼，梅燕

(武汉科技大学城市学院，武汉430083)

目的 探讨丹酚酸B对肾间质纤维化大鼠的肾保护作用及其机制，为丹酚酸B临床用于治疗肾间质纤维化提供依据。方法 取雄性SD大鼠45只随机均分为假手术组、模型组和丹酚酸B组，模型组和丹酚酸B组采用单侧输尿管结扎建立肾间质纤维化模型，假手术组游离输尿管和肾脏后不结扎。自手术第2天开始，丹酚酸B组予12.5 mg/kg丹酚酸B灌胃，假手术组、模型组予等量双蒸水灌胃，连续灌胃7天；灌胃结束时腹主动脉取血，处死大鼠，取梗阻侧肾组织。采用全自动生化分析仪检测血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，对梗阻侧肾组织进行HE、Masson染色，采用免疫组化法和Western blotting法检测梗阻侧肾组织转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织长成因子(CTGF)mRNA和蛋白表达。结果 模型组、丹酚酸B组BUN、Scr水平均高于假手术组，丹酚酸B组均高于假手术组，组间比较P均<0.05。HE染色和Masson染色结果显示，模型组、丹酚酸B组梗阻侧肾组织纤维化、炎性细胞浸润，但丹酚酸B组纤维化程度明显减轻、炎性细胞浸润明显减少。模型组、丹酚酸B组TGF-β1、CTGF mRNA和蛋白相对表达量均高于假手术组，丹酚酸B组均低于模型组，组间比较P均<0.05。结论 丹酚酸B对大鼠肾纤维化形成有抑制作用；下调TGF-β1、CTGF表达，调节TGF-β1/CTGF信号通路可能是其作用机制。

肾间质纤维化；丹酚酸B；转化生长因子β1；结缔组织生长因子；大鼠

肾间质纤维化是慢性肾病进展为终末期肾病的病理基础。其病理基础为肾脏胶原蛋白合成增加、降解减少，细胞外基质大量沉淀[1]。丹参是唇形科鼠尾草属植物，具有凉血消痈、祛瘀生新、活血调经等作用[2]。丹参总酚酸是丹参提取物，具有抗氧化、抗炎、改善肾功能等作用[3,4]。丹酚酸B是丹参总酚酸中主要水溶性活性成分之一，具有抗肝纤维化作用，但其对肾纤维化的影响及作用机制尚未明确[5,6]。2015年12月～2016年12月，本研究探讨了丹酚酸B对肾间质纤维化大鼠的肾保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠45只，清洁级，购自华中科技大学动物实验中心，体质量220～250 g，动物许可证号SYXK(鄂)2010-0057。丹酚酸B购自上海诗丹德标准技术服务有限公司(批号131010)，ELX800全自动酶标检测仪购自美国Bio-Tek公司。兔抗大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)抗体、兔抗大鼠结缔组织生长因子(CTGF)抗体、兔抗大鼠β-actin抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。免疫组化试剂盒购自美国Sigma公司。AU5800全自动生化分析仪、光学显微镜购自日本Olympus公司。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 肾间质纤维化模型建立及分组处理 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和丹酚酸B组，每组15只。模型组和丹酚酸B组采用单侧输尿管结扎建立肾间质纤维化模型。具体步骤：大鼠经乙醚麻醉，乙醇消毒切口处皮肤，自腹正中线偏左切开皮肤、打开腹腔并游离输尿管和肾脏，组织钳托起左侧输尿管中段并用止血钳夹住，用丝线将左侧输尿管远端和近肾盂段结扎，剪断结扎点之间的输尿管，缝合皮肤并关闭切口。假手术组游离输尿管和肾脏后不结扎，其余步骤同模型组。自手术第2天开始，丹酚酸B组予12.5 mg/kg丹酚酸B灌胃，假手术组、模型组均给予等量双蒸水灌胃，三组均持续给药7天。灌胃结束当天腹主动脉取血；处死大鼠，取梗阻侧肾组织。

1.3 相关指标观察

1.3.1 肾功能检测 取各组腹主动脉血标本，采用全自动生化分析仪检测血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。

1.3.2 肾组织病理学变化 取部分梗阻侧肾组织标本，甲醛固定，切片制成光镜标本，进行HE、Masson染色，光镜下观察肾组织病理学变化。

1.3.3 肾组织TGF-β1、CTGF表达检测 ①TGF-β1mRNA及CTGF mRNA表达：采用免疫组化法。取部分梗阻侧肾组织标本，石蜡包埋后常规切片；过氧化氢室温封闭10 min，PBS冲洗3次；37 ℃胃蛋白酶消化30 min，PBS冲洗3次；加入柠檬酸缓冲液并加热10 min。室温自然冷却，BSA封闭液37 ℃孵育0.5 h；滴加TGF-β1抗体(1∶100)和CTGF抗体(1∶100)，PBS液代替一抗作为阴性对照，4 ℃湿盒内过夜。PBS冲洗3次后滴加二抗，37 ℃湿盒内孵育0.5 h。DAB-过氧化氢显色剂显色5～8 min，水洗后苏木素复染，无水乙醇分化、脱水，封片后镜下观察。每组中每只大鼠制作3张切片，每个切片选取5个高倍镜视野，利用图像分析软件读片，以胞质或胞核出现清晰棕黄色颗粒为阳性，计算阳性染色面积占整个视野面积的百分比。②TGF-β1蛋白及CTGF蛋白表达：采用Western blotting法。取部分梗阻侧肾组织标本，匀浆器充分研磨后加入裂解液裂解并提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。根据目标蛋白大小配置适合浓度的凝胶、分离胶和浓缩胶。电泳加压转膜后脱脂奶粉封闭1 h。加入特异性TGF-β1抗体和CTGF抗体，稀释比例为1∶1 000，以β-actin(1∶5 000)作为对照。去除一抗，洗涤后加入二抗，室温孵育2 h，漂洗，化学发光法X片显影，采用Image J软件得到条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 三组血BUN、Scr水平比较 模型组、丹酚酸B组BUN、Scr水平均高于假手术组，丹酚酸B组均高于假手术组，组间比较P均<0.05。见表1。

表1 三组血BUN、Scr水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 三组肾组织病理学变化 HE染色结果显示，假手术组肾间质无改变，细胞结构完整、正常，肾小管上皮细胞排列整齐，间隙紧密，无炎性细胞浸润；模型组肾间质纤维组织增生，炎性细胞浸润小管间质，小管上皮细胞结构不完整，肾小管出现部分萎缩、坏死、扩张、闭塞；丹酚酸B组肾间质少量炎性细胞浸润，纤维组织轻度增生，部分小管上皮细胞结构完整，肾小管出现轻度扩张、闭塞和萎缩。Masson染色结果显示，假手术组肾小管间质染色较少，染色主要位于小管基底膜和管周围区域，可见小管基底膜连续、光滑；模型组肾小管扩张明显，管壁变薄，基底膜呈现不同程度断裂增厚，肾间质胶原成分增加、增宽，浸润炎性细胞增多；丹酚酸B组肾间质纤维化程度明显减轻，肾间质变窄，胶原成分减少。

2.3 三组肾组织TGF-β1、CTGF表达比较 假手术组TGF-β1、CTGF阳性染色细胞平均分布于肾小管和肾小球基膜；模型组TGF-β1、CTGF大量表达于肾间质，肾小管和肾小球基膜上也有分布；丹酚酸B组TGF-β1、CTGF中等程度不均匀表达于肾间质，肾小管和肾小球基膜上也有少量分布。模型组、丹酚酸B组TGF-β1、CTGF阳性染色面积占整个视野面积的百分比和蛋白相对表达量均高于假手术组，丹酚酸B组均低于模型组，组间比较P均<0.05。见表2、3。

表2 三组肾组织TGF-β1、CTGF mRNA表达比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

表3 三组肾组织TGF-β1、CTGF蛋白相对表达量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

肾脏原发病进展至终末期均表现为细胞外基质沉积、肾实质细胞减少、肾间质纤维化及细胞外基质在肾间质内过度沉积，其中肾间质纤维化被认为是几乎所有肾脏疾病进展为终末期肾病的共同病理改变。中医认为，慢性肾功能衰竭是由于肾脏络脉阻滞、瘀血内阻致脾肾衰败、瘀浊内壅[7]。丹参性微寒、味苦，入肝经、心、心包，有药用价值的部分主要是根茎和干燥根。药理学研究表明，丹参具有凉血消痈、祛瘀止痛、活血通络、清心除烦等作用，对心脑血管系统、免疫系统、中枢神经系统、呼吸系统等多个系统均具有保护作用[8,9]，可用于治疗心绞痛、心烦不眠、经闭痛经、肝脾肿大等多种疾病。对于单味中药单一成分的研究可以明确该成分的作用效果和作用机制。丹酚酸B是丹参总酚酸(丹参提取物)中主要的水溶性活性成分之一，具有良好的抗肝纤维化作用[10]，但其对肾纤维化的作用报道较少。

单侧输尿管梗阻是目前较成熟的制备肾间质纤维化模型的方法，且啮齿类动物的纤维化特征与人类相似，因此本研究采用单侧输尿管梗阻制备肾纤维化模型。本研究结果显示，模型组、丹酚酸B组BUN、Scr水平均高于假手术组，提示肾纤维化大鼠模型肾功能受损；丹酚酸B组BUN、Scr均高于假手术组，提示丹酚酸B可改善肾纤维化大鼠肾功能。进一步对梗阻侧肾组织进行HE染色和Masson染色，结果显示模型组、丹酚酸B组肾组织存在纤维化，但丹酚酸B组纤维化程度明显减轻、炎性细胞浸润明显减少；提示丹酚酸B能够抑制肾间质纤维化病理改变。

TGF-β1是TGF-β家族成员之一，具有免疫抑制功能[11]，也是传统的促纤维化因子，在肾脏中表达量最多。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是细胞外基质的主要来源。TGF-β1通过刺激肾小管上皮细胞促进α-SMA表达，阻断TGF-β1后α-SMA表达显著降低[12,13]。因此，TGF-β1被认为能够促进细胞外基质的形成和肾小球纤维化[14]。有研究认为，丹酚酸B能够抑制TGF-β1产生，抑制Smad2、Smad3磷酸化，通过TGF-β1/Smads信号通路调节肾纤维化[15]。但TGF-β1具有双向调节作用，即在成纤维细胞和肾小球系膜细胞中，低浓度TGF-β1促进增殖、高浓度抑制增殖；适量的激活TGF-β1能够发挥免疫调节、抗炎、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、修复损伤创面、重塑生理结构等作用。因此，单纯拮抗TGF-β1并不一定能延缓肾脏纤维化的进展；因为阻抑TGF-β1的同时也抑制了TGF-β1的免疫调节和抗炎等生物学效应，甚至引起肾功能进行性减退[13]。CTGF是一种分泌性多肽，富含半胱氨酸，广泛分布于人体多个组织器官中，与纤维化进程密切相关。在CTGF启动子序列中发现了TGF-β1的反应元件，推测CTGF可能是TGF-β1的下游因子。正常肾小管上皮细胞CTGF低表达，采用TGF-β1干预后CTGF表达明显升高，细胞外基质合成与分泌显著增加。Shi等[16]研究认为，在病理状态下CTGF表达上调与部分纤维化性疾病和增生性疾病密切相关。由于CTGF功能相对单一，因此其有望成为代替TGF-β1作为纤维化疾病治疗的新靶点。本研究结果显示，模型组和丹酚酸B组TGF-β1、CTGF mRNA和蛋白表达量均高于假手术组，丹酚酸B组均低于模型组；提示肾脏纤维化形成过程中TGF-β1、CTGF表达显著上调，TGF-β1、CTGF表达增加或活化参与了肾脏纤维化的作发生。丹酚酸B可抑制TGF-β1、CTGF表达，调节TGF-β1/CTGF信号通路，降低细胞外基质的合成与分泌，干预肾纤维化进程，发挥抗纤维化作用。

综上所述，丹酚酸B灌胃对大鼠肾纤维化形成有抑制作用。其作用机制可能与下调肾组织中TGF-β1、CTGF表达，调节TGF-β1/CTGF信号通路有关。本研究的不足为未建立TGF-β1、CTGF基因切除大鼠进行反面验证。此外，中药单体可能具有多个作用靶点，丹酚酸B是否可以通过其他途径发挥肾脏保护作用仍需进一步探索。

[1] Chen X, Wei SY, Li JS, et al. Overexpression of heme oxygenase-1 prevents renal interstitial inflammation and fibrosis induced by unilateral ureter obstruction[J]. PLoS One, 2016,11(1):e0147084.

[2] Zhu Z, Ding L, Qiu WF, et al. Salvianolic acid B protects the myelin sheath around injured spinal cord axons[J]. Neural Regen Res, 2016,11(3):487-92.

[3] 陈雯,郭丽丽,周婷婷,等.丹参总酚酸对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(9):173-176.

[4] Kan S, Chen Z, Shao L, et al. Transformation of salvianolic acid B to salvianolic acid a in aqueous solution and the in vitro liver protective effect of the main products[J]. J Food Sci, 2014,79(4):C499-C504.

[5] Masola V, Zaza G, Secchi MF, et al. Heparanase is a key player in renal fibrosis by regulating TGF-β expression and activity[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1843(9):2122-2128.

[6] Park HJ, Kim HG, Wang JH, et al. Comparison of TGF-β, PDGF, and CTGF in hepatic fibrosis models using DMN, CCl4, and TAA[J]. Drug Chem Toxicol, 2016,39(1):111-118.

[7] 郝一鸣,洪名超,王文静,等.慢性肾功能衰竭中医不同证型患者尿液相关蛋白研究[J].中国中西医结合杂志,2012,32(9):1196-1199.

[8] Zhang X, Guan H, Dai Z, et al. Functional analysis of the isopentenyl diphosphate isomerase of salvia miltiorrhiza via color complementation and RNA interference[J]. Molecules, 2015,20(11):20206-20208.

[9] Guo Y, Li Y, Xue L, et al. Salvia miltiorrhiza: an ancient Chinese herbal medicine as a source for anti-osteoporotic drugs[J]. J Ethnopharmacol, 2014,155(3):1401-1416.

[10] Gao HY, Li GY, Lou MM, et al. Hepatoprotective effect of Matrine salvianolic acid B salt on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis[J]. J Inflamm (Lond), 2012,9(1):16.

[11] 陈丽红,黄爱民,刘景丰,等.转化生长因子-β1基因修饰的不成熟树突状细胞的免疫生物学功能[J].中华实验外科杂志,2011,28(11):1866-1868.

[12] Chen N, Hao J, Li L, et al. Carboxy-terminal modulator protein attenuated extracellular matrix deposit by inhibiting phospho-Akt, TGF-β1and α-SMA in kidneys of diabetic mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,474(4):753-760.

[13] Wang Y, Lin C, Ren Q, et al. Astragaloside effect on TGF-β1, SMAD2/3, and α-SMA expression in the kidney tissues of diabetic KKAy mice[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(6):6828-6834.

[14] Liu M, Zheng M, Xu H, et al. Anti-pulmonary fibrotic activity of salvianolic acid B was screened by a novel method based on the cyto-biophysical properties[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,468(1-2):214-220.

[15] Zhang M, Cao SR, Zhang R, et al. The inhibitory effect of salvianolic acid B on TGF-β1-induced proliferation and differentiation in lung fibroblasts[J].Exp Lung Res, 2014,40(4):172-185.

[16] Shi C, Li G, Tong Y, et al. Role of CTGF gene promoter methylation in the development of hepatic fibrosis[J]. Am J Transl Res, 2016,8(1):125-132.

湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(B2016439)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.010

R692

A

1002-266X(2017)20-0034-04

2017-02-23)