注射用间苯三酚的非临床安全性评价

王 欣，周继春，景爱华，雷万军

注射用间苯三酚的非临床安全性评价

王 欣1，周继春1，景爱华2，雷万军2

目的 对注射用间苯三酚进行临床前动物安全性评价试验。方法 豚鼠全身主动过敏性试验(ASA)：在首次注射后第14天、第21天由耳缘静脉注射供试品，观察30 min后动物过敏反应；豚鼠被动皮肤过敏性试验(PCA)：皮内注射抗血清被动致敏，24 h后注射伊文思兰，测量蓝色反应斑；体外溶血试验：观察供试品3 h内有无溶血和凝聚现象；血管刺激性试验：家兔连续5 d耳缘静脉注射供试品，观察其对注射局部血管的刺激；肌肉刺激性试验：家兔后肢股四头肌内注射供试品，观察其对肌肉组织的刺激。结果 注射用间苯三酚豚鼠过敏性试验中均未发生过敏反应，溶血性试验3 h内未发生溶血和凝聚现象，血管刺激性试验和肌肉刺激性试验均未出现刺激性反应。结论 注射用间苯三酚无过敏性反应、刺激性反应及溶血性，使用安全可靠。

注射用间苯三酚；安全性试验；过敏反应；溶血试验；刺激性试验

间苯三酚是一种纯平滑肌解痉药，属非阿托品及非罂粟碱类且具有亲肌性的特点，能直接作用于消化系统、泌尿系统及生殖道的平滑肌，在妇科、泌尿科及胃肠科等领域应用广泛，已成为治疗痉挛性疼痛的首选药物[1-2]。本研究按照药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[3]，对注射用间苯三酚进行了安全性试验，现报道如下。

1 材料

1.1 药物及试剂 注射用间苯三酚(批号：20131101，规格：80 mg，开封明仁药业有限公司生产)；牛血清白蛋白(批号：A8020，规格：5 g，瑞士罗氏公司)；伊文思兰(批号：08-11-02，上海化学试剂采购供应站分装厂进口分装)；甲醛(批号：20131002，烟台市双双化工有限公司)；葡萄糖注射液(批号：14070915，规格：100 mL∶5.0 g，开开援生制药股份有限公司)。

1.2 实验动物 新西兰家兔，普通级，体质量2.0～3.0 kg，雌雄不拘，单笼饲养；豚鼠，清洁级，体质量250～350 g，雌雄不拘，分笼饲养；均购自华兰生物疫苗有限公司，许可证号：SCXK(豫)2010-0001；实验动物使用许可证号：SYXK(豫)2010-0008；饲养条件：全价营养饲料；温度控制(23±2) ℃，湿度50%～65%，自由饮水，良好通风，12 h光照明暗交替；豚鼠每日另供给新鲜蔬菜，保持动物健康状态。

1.3 仪器 CP225D型电子天平(德国赛托利斯公司)；UW8200S型电子天平(日本岛津公司)；SF2000型电子数显卡尺(桂林广陆数字测控股份有限公司)；GD100型恒温循环水浴锅(英国Grant公司)；CH30型显微镜(日本奥林巴斯公司)；RTZ-10A-RT型婴儿秤(无锡市衡器厂)。

2 方法与结果

2.1 人与受试动物剂量换算

注射用间苯三酚稀释于5%或10%葡萄糖注射液中静脉滴注，每日剂量可达200 mg。公式(2)、(3)中d为实验动物体质量剂量，R为动物体型系数[4]。

按公式(1)计算临床最大成人用剂量(人以60 kg计)：

(1)

按公式2折算成豚鼠等效剂量(豚鼠以300 g计)：

(2)

按公式3折算成家兔等效剂量(家兔以2.5 kg计)：

(3)

2.2 全身主动过敏性试验(active systemic anaphylaxis，ASA)

取豚鼠24只，随机分为4组[3-6]：阴性对照组、阳性对照组、供试品高剂量组、供试品低剂量组，每组6只；分别给予葡萄糖注射液、1%牛血清白蛋白、注射用间苯三酚，高剂量组致敏剂量为33.3 mg·kg-1，激发剂量为66.7 mg·kg-1，给药浓度为20 mg·mL-1；低剂量组给予注射用间苯三酚，致敏剂量为16.7 mg·kg-1，激发剂量为33.3 mg·kg-1，给药浓度为10 mg·mL-1。于实验第1、3、5天每只豚鼠腹腔注射各组对应试液0.5 mL进行致敏。然后再将各组均分为2组，于实验第14天和第21天由耳缘静脉注射各组对应试液1.0 mL进行激发。注射后观察30 min内每只动物的反应，记录7 d内动物出现的反应，根据过敏反应发生率和发生程度进行综合判断。

结果：阳性对照组2只豚鼠出现打喷嚏、咳嗽反应、2只豚鼠死亡，为极强阳性(++++)；阴性对照组未出现过敏反应；判断实验成立。注射用间苯三酚高、低剂量组在注射后及观察期豚鼠均未发生过敏反应。

2.3 被动皮肤过敏性试验(passive cutaneous anaphylaxis，PCA)

抗体的制备：取豚鼠8只，随机分为4组[3-6]：阴性对照组、阳性对照组、供试品高剂量组、供试品低剂量组，每组2只，分别给予葡萄糖注射液、1%牛血清白蛋白、注射用间苯三酚，高剂量组致敏剂量为33.3 mg·kg-1，给药浓度为20 mg·mL-1；低剂量组致敏剂量为16.7 mg·kg-1，给药浓度为10 mg·mL-1。于实验第1、3、5天每只豚鼠腹腔注射各组对应试液0.5 mL进行致敏。于实验第14天采血，离心10 min(2 000 r·min-1)分离上层血清，合并得混合抗血清。保存于-20 ℃，14 d内使用。

实验方法：取豚鼠24只，分组及给药同抗体的制备项下方法。豚鼠背部去毛约3 cm×4 cm，将各组混合抗血清按1∶4稀释，皮内注射0.1 mL，进行被动致敏。24 h后进行激发，于耳缘静脉注射含1%伊文思兰的各组对应试液1.0 mL。注射后0.5 h剪取豚鼠注射部位周边皮肤，测量皮肤内层蓝斑直径，进行数据处理。

结果：阳性对照组豚鼠蓝色反应斑直径为(18.63±2.33)mm，均大于5 mm，为阳性；阴性对照组和注射用间苯三酚高、低剂量组豚鼠均未出现蓝色反应斑，为阴性。

2.4 溶血性试验

2%红细胞混悬液的制备：抽取家兔心脏血约25 mL，立即放入含玻璃珠的干燥锥形瓶中不间断振摇10 min，将纤维蛋白原除去，制成脱纤血液；将10 mL脱纤血液置离心管中，加生理盐水40 mL，摇匀，离心10 min(1 000 r·min-1)，除去上清液，沉淀的红细胞再依上法进行2～3次，直至上清液不显红色。将所得红细胞用生理盐水制成2%红细胞混悬液。

试验方法[3-6]：取干燥洁净试管8支，1号为阴性对照管，2号为阳性对照管，3号为供试品对照管，4～8号为供试品管。按表1依次加入2%红细胞悬液、生理盐水、纯化水、间苯三酚(4 mg·mL-1)，混匀后立即置水浴锅内(37±0.5) ℃的，于第15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h观察，并记录实验现象。

表1 溶血性试验加样方法

结果：阴性对照管无溶血及凝聚现象，阳性对照管发生溶血现象，溶液澄明红色，管底几乎未见红细胞残留；注射用间苯三酚各管未见溶血和凝聚发生，上清液无色澄明，管底下沉的红细胞经振摇后可均匀分散。置显微镜下观察红细胞形态，注射用间苯三酚各管和阴性对照管红细胞形态均正常。

2.5 血管刺激性试验

取家兔4只，于耳缘静脉注射给予受试物，采用同体左右侧自身对比法[3-5]，左侧注射葡萄糖注射液，右侧注射间苯三酚10 mL·kg-1，给药浓度为0.8 mg·mL-1)。每天1次，连续5 d。每次给药前对动物和注射部位进行肉眼观察，末次给药后48、72、96 h同法观察并记录，取2只家兔的耳缘静脉近心端血管2～3 cm供病理组织学检查，另2只动物再观察14 d后同法检查，观察刺激性反应的可逆程度。

结果：根据肉眼观察和病理组织学检查的结果综合判断，家兔左右侧注射部位皮肤、静脉均呈现相似的变化，未见明显充血、水肿、硬结及坏死等异常现象，血管基本正常；病理组织学检查无明显异常，见图1。

2.6 肌肉刺激性试验

取家兔4只，试验前24 h左右后肢内侧剃毛约3 cm×5 cm。于后肢股四头肌内注射受试物，采用同体左右侧自身对比法[3-5]，左侧注射葡萄糖注射液，右侧注射间苯三酚32 mg·kg-1，给药浓度为16 mg·mL-1，给药容积均为每只5.0 mL。观察给药后注射局部的肌肉有无红肿、充血等反应。于注射后48 h取出家兔股四头肌，观察肌肉组织有无变化并做肌肉病理学检查。

结果：在规定的时间内观察，注射局部肌肉未出现充血、红肿、变性、坏死等反应，左右侧自身对比肌肉刺激反应均为0级(即无明显变化)，家兔肌肉基本正常；局部病理组织学检查亦无明显异常，见图2。

A：给药期空白对照组 B：给药期受试药物组C：恢复期空白对照组 D：恢复期受试药物组图1 镜下血管观察图

A：空白对照组 B：受试药物组图2 镜下肌肉观察图

3 讨论

注射药物安全性评价是药物临床前试验研究的重要组成部分，注射剂产品在临床使用的风险性较高，与其他剂型比较，更需加强安全性的技术要求和风险控制。临床前药理毒理研究是药物临床前试验的非常重要的组成部分，为临床安全合理用药及新药注册提供参考。其中一项重要内容是药物过敏性、溶血性和刺激性试验。本试验受试药物的剂量按照注射用间苯三酚临床使用剂量和人与受试动物等效剂量设计，能够反映出药物使用中出现的可能不良反应。过敏性试验中综合预实验结果，即剂量为66.7 mg·kg-1时，动物均未出现毒性反应。因此，高剂量组致敏剂量设计为33.3 mg·kg-1，即人临床使用等效剂量2倍，激发剂量则为4倍，溶血性试验剂量设计为人临床使用等效剂量的5倍，肌肉刺激性试验为4倍，血管刺激试验与人临床使用等效剂量相同，均不低于临床拟用浓度。

目前注射用间苯三酚临床使用较为广泛，主要用于妇产科流产[7-8]、胃肠道疼痛[9-11]、肾绞痛[13]等疼痛的缓解，多与其他药物联合使用。目前临床资料显示其不良反应发生率低。秦炜等[12]将242例晚期流产的患者分为两组，分别使用间苯三酚和硫酸镁进行疗效和不良反应的比较，结果显示间苯三酚起效时间快、治疗疗程短、保胎成功率高，明显优于硫酸镁，而不良反应发生率仅为4.13%，明显低于对照组的29.75%。郝丹[13]将100例肾绞痛患者分为两组，分别使用山莨菪碱和间苯三酚进行治疗，结果间苯三酚组总有效率为98%，而山莨菪碱组为88%，间苯三酚组不良反应发生率为10%，明显低于山莨菪碱组的24%。

本试验结果发现，注射用间苯三酚对豚鼠无致敏性，溶血性试验中未引起红细胞溶血和凝聚，对家兔血管、肌肉无刺激性。说明注射用间苯三酚起效快、不良反应少、安全可靠，具有较高的临床使用优势及前景。

[1] 李健和,易利丹,彭六保,等.间苯三酚的药理作用与临床应用[J].中国新药与临床杂志, 2011,30(7):494-499.

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Nonclinical Safety Evaluation of Phloroglucinol Dehydrate Injection

WANG Xin1, ZHOU Ji-chun1, JING Ai-Hua2, LEI Wan-jun2

(1.Henan Provincial Institute of Food and Drug Control, Zhengzhou 450008,China;2.School of Medical Technology and Engineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

ObjectiveTo evaluate the preclinical animal safety of phloroglucinol dehydrate injection.MethodsActive systemic anaphylaxis was investigated in guinea pigs when phloroglucinol dehydrate injection was injected on 14 d and 21 d after the first treatment．Passive cutaneous anaphylaxis was investigated in guinea pigs by intravenous injection of evans blue at 24 h after intracutaneous injection of serum antibodies for observing blue reaction spots. In the in vitro hemolytic test，hemolysis and coagulation were observed in 3 h．In the vessel stimulation test，the local blood vessel stimulation was observed after injecting phloroglucinol dehydrate injection for successively 5 d．In the muscle stimulation test, the muscular tissue stimulation was observed after injecting phloroglucinol dehydrate injection in the rabbit hind leg quadriceps.ResultsThere was no allergic reaction to the guinea pigs，no hemolytic and coagulation reaction in the hemolytic test and no stimulation to ear vein and muscular tissue in the vessel and muscle stimulation test.ConclusionPhloroglucinol dehydrate injection was safe and reliable without allergic reaction, stimulation response and haemolyticus.

phloroglucinol dehydrate injection；safety test；allergic reation；hemolytic test；stimulation test

1672-688X(2017)02-0100-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.006

2017-03-17

1.河南省食品药品检验所，河南郑州 450008 2.河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳 471023

王欣(1978—)，女，河南柘城人，主管药师，从事药品检验药理方面研究。

R965.3

A