液相色谱-串联质谱法测定尿液中的泛酸

张小涛，章云飞，侯宏卫，陈 欢，刘 勇，王 安，胡清源*

(1.国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001；2．中国科学院 合肥物质科学院 应用技术所，安徽 合肥 230031；3.河南省肿瘤医院，河南 郑州 450008)



液相色谱-串联质谱法测定尿液中的泛酸

张小涛1,2，章云飞3，侯宏卫1*，陈 欢1，刘 勇2，王 安2，胡清源1,2*

(1.国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001；2．中国科学院 合肥物质科学院 应用技术所，安徽 合肥 230031；3.河南省肿瘤医院，河南 郑州 450008)

该文建立了检测尿液中泛酸含量的液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法，尿液经过离心、稀释后，采用ACPUITY UPLC SS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱进行分离，电喷雾正离子模式电离，多反应监测模式进行检测，方法的线性关系良好(r=0.999 3)，方法检出限为0.46 ng/mL，回收率为87.9%～95.3%，相对标准偏差(RSD)为2.5%～13.0%。该方法具有灵敏度高、分析时间短等特点，可用于尿液中泛酸含量的分析。

液相色谱-串联质谱；尿液；泛酸；生物监测

泛酸又称维生素B5、遍多酸,是一种水溶性维生素,几乎存在于所有活细胞中。泛酸是生物机体正常生理代谢所必需的营养素，是辅酶A(CoA)的前体，而CoA则是泛酸发挥功能的生物活性形式[1]，含碳架物质产生能量及许多细胞结构的形成均需泛酸参与，摄食不足或生理状态的改变均可引起泛酸缺乏[2]。泛酸缺乏可使需要CoA的反应受到抑制，主要影响脂肪酸代谢，使脂肪酸β-氧化受到抑制，进而导致高血脂等，严重者可产生脑部损害[3]。另外，泛酸还具有抗脂质过氧化作用，对遭受脂质过氧化损伤的细胞和大鼠具有很好的保护作用，可能是通过CoA形式清除自由基或CoA促进磷脂合成，从而促进修复[4]。摄入体内的过量的泛酸会随尿液排出，且泛酸的摄入量和尿液中的排泄量之间存在一定的相关性[5]，因此尿液中泛酸的含量可以作为评价泛酸摄入的有效营养指标。

目前，尿液中泛酸含量的测试方法主要有高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FL)和液相色谱-质谱联用方法(LC-MS或LC-MS/MS)，如Fukuwatari等[6]采用同位素反向离子对柱后衍生化的方法测定了尿液中的泛酸含量，但该方法需使用离子对试剂及柱后衍生化，前处理相对繁琐；Heudi等[7]建立了尿液中泛酸含量的液相色谱-质谱检测方法，方法简单，但灵敏度较低；最近，液相色谱-串联质谱方法(LC-MS/MS)被广泛用于食品[8-10]和血清[11]中泛酸含量的测定，Gosetti等[12]利用LC-MS/MS法分析橄榄油中8种多酚和泛酸，该方法灵敏度较高，其中泛酸的检出限为0.3 μg/L，说明LC-MS/MS方法比HPLC和LC-MS方法更适于泛酸的定量分析，目前未见采用LC-MS/MS测定尿液中泛酸含量的报道。本文建立了LC-MS/MS测定尿液中泛酸含量的方法，并利用建立的方法对喉癌志愿者和健康志愿者尿液中的泛酸含量进行定量分析。相比已有方法，本研究灵敏度较高，适用于尿液中泛酸含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200快速液相色谱仪(包括G1367D 自动进样器、G1312B 二元溶剂泵、G1316B柱温箱)(安捷伦科技有限公司)；AB Sciex 5500三重四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司)。

泛酸(纯度为95%，武汉易泰科技有限公司上海分公司)；甲酸(纯度大于96%，Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色谱纯，CINC高纯溶剂有限公司)；实验用水采用Milli-Q纯水仪过滤。

1.2 标准溶液的配制

准确称取10 mg泛酸于10 mL容量瓶中，加入0.1%甲酸水溶液定容，混合均匀，即得泛酸的储备液。取储备液逐级稀释，即得标准溶液和工作溶液。

1.3 样品前处理

尿液在室温下解冻、离心后，移取100 μL于10 mL的容量瓶中，用0.1%的甲酸溶液定容，混合均匀后，移取约 1 mL放入1.8 mL的色谱瓶中，待LC-MS/MS进行分析。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：所有样品均采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)进行分离，色谱柱温度为35 ℃;流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈；进样量为5 μL；流速为200 μL/min。梯度条件：0～1 min，5%B；1～5 min，5%～100%B；5～6 min，100%B，6～6.3 min，100%～5%B；6.3～8 min，5%B。

质谱条件：采用多反应监测模式，离子源为电喷雾离子源，扫描方式为正离子，电喷雾电压为 5 500 V,碰撞气：9 psi,气帘气：40 psi，辅助加热气：30 psi，温度：500 ℃，射入电压为10 V，驻留时间为100 ms，所采用的定性和定量离子对的质荷比分别为m/z220.3→90.1和m/z220.3→202.2。

1.5 数据处理

所用数据采用Analyst 1.5.1进行分析，T检验采用SPSS 20.0进行分析。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

采用针泵，在电喷雾正离子模式下，以10 μL/min的速度向质谱中注入1 μg/mL泛酸标准溶液，泛酸的母离子形式有[M+H]+和[M+Na]+两种，且[M+Na]+的响应强于[M+H]+，因此在标准品中加入了0.1%的甲酸，根据电离平衡原理，甲酸的加入会使溶液中[M+H]+离子的响应明显增强，且远超过[M+Na]+，得到泛酸的母离子质荷比为m/z220.3，然后采用产物离子扫描的方式寻找泛酸的子离子，当去簇电压为90 V时，泛酸的子离子质荷比分别为m/z90.1和m/z202.2，即所使用的定性和定量离子对质荷比分别为m/z220.3→90.1和m/z220.3→202.2。进一步对定量和定性离子对的碰撞能量进行优化，获得最佳碰撞能量分别为18.2 eV和20.4 eV 。优化的质谱条件见“1.4”。

图1 标准溶液的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of standard solution

2.2 色谱条件的优化

由于泛酸的极性较强，在常规C18色谱柱上的保留比较弱，因此选取Waters的ACPUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱对尿液样本进行分离，并对色谱柱温度和流动相比例进行优化。选择色谱柱温度为35 ℃，流动相为0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈，流速为200 μL/min，采用“1.4”中的梯度洗脱条件，泛酸标准溶液的色谱图如图1所示。由图1可见，泛酸在Waters的ACPUITY UPLC HSS T3色谱柱上有较好的保留，且峰形尖锐对称，其保留时间为2.94 min。

2.3 方法学研究

在优化条件下，将标准工作溶液分别稀释成质量浓度为3.6，6，30，60，120，240，360 ng/mL的工作溶液，以泛酸的浓度(x,mg/mL)为横坐标，对应的峰面积(y)为纵坐标，绘制泛酸的标准曲线，标准曲线方程为y=3.84×103x+7.71×103，其线性良好，相关系数(r)为0.999 3。以3倍和10倍信噪比(S/N)分别计算方法的检出限和定量下限，得到方法的检出限为0.46 ng/mL，定量下限为1.54 ng/mL。

表1 方法的回收率与精密度(n=6)

选取5个尿液样本混合均匀，测得其泛酸含量为72.35 ng/mL，然后分别向其中加入低、中、高(12.00，180.0，240.0 ng/mL) 3个浓度水平的泛酸标准溶液，每个浓度平行制样6个，采用LC-MS/MS进行检测，计算方法的回收率。结果显示，3种加标水平下的回收率分别为95.3%，88.9%，87.9%；相对标准偏差分别为13.0%，2.8%，2.5%，可以满足分析要求。

选取低、中、高3个水平(6,60，240 ng/mL)分别做溶剂和尿液的加标回收实验，然后根据目标分析物在溶剂和尿液中的峰面积来计算基质效应，发现在尿液中均存在基质抑制效应，低、中、高3个浓度水平的基质抑制分别为33.3%，28.7%和21.3%。

图2 尿液中泛酸含量的箱线图Fig.2 The box plot of urinary pantothenic acid

2.4 方法应用

利用建立的 LC-MS/MS方法对26个健康志愿者和33个喉癌志愿者尿液中泛酸的浓度进行分析(图2)，测得健康志愿者尿液中泛酸的浓度为0.21～18.5 μg/mL，平均浓度为8.71 μg/mL；喉癌志愿者尿液中泛酸的浓度为1.49～20.1 μg/mL，平均浓度为8.97 μg/mL。采用T检验对两组样本之间的差异显著性进行了检验，发现泛酸在喉癌志愿者和健康志愿者之间无明显差异(P>0.05)，说明喉癌对于尿液中的泛酸的含量影响不大。

3 结 论

本文建立了LC-MS/MS测定尿液中泛酸含量的分析方法，方法具有灵敏度高、分析时间短等特点。利用建立的方法对26个健康志愿者和33个喉癌志愿者尿液中泛酸的浓度进行了分析，结果表明喉癌志愿者尿液中泛酸的平均含量和健康志愿者之间无显著性差异。

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Determination of Pantothenic Acid in Human Urine by Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xiao-tao1,2,ZHANG Yun-fei3,HOU Hong-wei1*,CHEN Huan1,LIU Yong2,WANG An2,HU Qing-yuan1,2*

(1.China National Tobacco Quality Supervision & Test Center,Zhengzhou 450001,China;2.Institute of Applied Technology,Hefei Institutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences,Hefei 230031,China; 2.Henan Tumor Hospital,Zhengzhou 450008,China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS)method for the determination of pantothenic acid in urine was developed and validated.After centrifugation and dilution,the sample was separated on an ACPUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm) column produced by the Waters corporation,and ionized in electro spray positive ion mode,then detected using multi-reaction monitoring mode.The calibration curve has a good linear range with a correlation coefficient(r) of 0.999 3.The limit of detection is 0.46 ng/mL,the recoveries are in the range of 87.9%-95.3%,and the RSDs are in the range of 2.5%-13.0%.The method has the advantages of high sensitivity and short analysis time,and could be used to analyze pantothenic acid in human urine.

liquid chromatography tandem mass spectrometry;urine;pantothenic acid;biomonitoring

2017-01-19;

2017-02-26

国家自然科学基金项目(21277174)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.019

O656.63；Q563

A

1004-4957(2017)06-0809-04

*通讯作者：侯宏卫，博士，研究员，研究方向：烟草质量监督与检验、吸烟与健康研究，Tel:0371-67672727,E-mail：qsfctc@163.com 胡清源，博士，研究员，研究方向：烟草质量监督与检验、吸烟与健康研究，Tel:0371-67672601,E-mail：huqy1965@163.com