柱前衍生/高效液相色谱法测定果蔬中仲丁胺残留

周 蓉，曹赵云，赵肖华，林晓燕，牟仁祥

(中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310006)



柱前衍生/高效液相色谱法测定果蔬中仲丁胺残留

周 蓉，曹赵云，赵肖华，林晓燕，牟仁祥*

(中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310006)

建立了高效液相色谱(HPLC)测定仲丁胺的分析方法。试样采用全自动凯氏定氮仪蒸馏，蒸馏液经碱中和，以9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)为衍生剂在碱性条件下衍生，衍生产物经C18柱分离，紫外检测器(265 nm)检测。实验考察了衍生剂浓度、硼酸盐缓冲溶液的pH值、反应温度与时间等因素对衍生反应的影响，结果表明，最优的衍生剂浓度为0.50 g/L，缓冲溶液pH值为8.0，反应温度为室温，反应时间为15 min。在此条件下，仲丁胺在0.001～1.000 mg/L浓度范围内与其响应信号呈良好的线性关系，相关系数为0.999 8，加标回收率为82.4%～95.2%，相对标准偏差为1.3%～6.8%，方法检出限为0.1 μg/kg，定量下限为0.5 μg/kg。该方法快速、简便、安全、灵敏度高、重现性好，可用于果蔬中仲丁胺残留的测定。

柱前衍生；高效液相色谱；全自动凯氏定氮仪；仲丁胺；果蔬

仲丁胺 ( 2-Aminobutane)，又名2-氨基丁烷，是一种保护性杀菌剂，可有效地抑制根霉、青霉和绿霉等真菌的生长和繁殖，广泛应用于柑橘、苹果、梨、桃、葡萄及香蕉等水果的贮藏期防腐[1]。果蔬中一定量的防腐剂、保鲜剂可保证贮藏期间的果蔬品质，仲丁胺作为常用的果蔬防腐剂具有一定的毒性，人们食用含有仲丁胺的食品后，仲丁胺一部分随尿排出，而另一部分会积累在肾脏中。国际上已将其对人体健康的危害列为三级，对其限量标准也在不断提升，已成为农产品进出口贸易技术壁垒的瓶颈[2]。农业部行业标准NY/T 946-2006采用薄层色谱法检测仲丁胺残留量[3]，最低检出限量为0.672 mg/kg。我国农业行业标准(NY/T 844-2010)规定仲丁胺在绿色食品葡萄中不得检出(<0.7 mg/kg)[4]。因此，建立一种前处理更为简便安全，检测方法灵敏度更高的仲丁胺残留检测分析方法是非常必要的。

目前，国内外关于仲丁胺的检测方法主要包括薄层色谱法(TLS)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)等[1,2,5-10]。但TLS法检测程序复杂，灵敏度低，分离度和重现性差。GC和GC-MS法对样品前处理条件要求苛刻，重复性不理想，且GC-MS和HPLC-MS仪器昂贵。相对于其他方法，HPLC-UV具有抗干扰能力强、分析时间较短、灵敏度高的优点。由于仲丁胺的分子量小，且结构上无生色基团用于最终检测，因此多采用柱前衍生法。常用于仲丁胺检测的衍生剂有丹酰氯(DNS-Cl)[11-13]、荧光胺[14]、2，4-二硝基氟苯(DNFB)[4]和9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)[15-19]。这些衍生剂一般都有较强的紫外吸收基团和荧光发射基团，可与仲丁胺的NH2反应生成相应的衍生物。但有些衍生剂具有一定的缺陷，如丹酰氯(DNS-Cl)需在避光条件下衍生，且试剂本身易降解，很难定量；2，4-二硝基氟苯(DNFB)的衍生化反应时间长，衍生物的稳定性差。而9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)在温和条件下即可与伯胺、仲胺迅速发生定量反应，衍生化产物稳定，且过量的衍生剂及其水解产物不干扰测定，是一种理想的衍生化试剂。经典的仲丁胺提取法是采用凯氏定氮法检测仲丁胺，该法操作步骤繁琐耗时、操作误差偏大、难以实现自动化。本文采用全自动凯氏定氮仪，该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及数字自动显示装置，操作方法简单、蒸馏速度快，结果准确可靠，是一种极具应用潜力的蒸馏装置，且应用全自动凯氏定氮仪作为仲丁胺前处理的蒸馏装置在测定仲丁胺的分析方法中尚未见报道。

本文采用全自动凯氏定氮仪对果蔬样品进行快速蒸馏，结合柱前衍生技术，建立了操作简便、灵敏度高的衍生化/高效液相色谱法，方法具有准确、快速、方便、安全的优势，可满足大批量样品中仲丁胺快速检测的需要。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有G1315D型二极管阵列检测器；K9840自动凯氏定氮仪(济南海能仪器)；S220精密pH计(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；WH-866旋涡混匀器(太仓市华利达实验设备有限公司)；冷冻离心机(美国ThermoFisher公司)；ZWY-110X30电热恒温振荡水槽(上海智城分析仪器制造有限公司)。

乙腈(ACN，色谱纯，美国Fisher公司)；硼酸、硼酸氢钠(美国Sigma公司)；衍生化试剂FMOC(纯度为98%，美国Acros Organics公司)；去离子水由Milli-Q纯化水系统制得(美国Millipore Corp)。仲丁胺标准品(纯度为99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)。

1.2 溶液的配制

硼酸盐缓冲液(pH 8.0)：称取硼酸9.27 g，加水400 mL溶解，用400 g/L NaOH溶液调至pH 8.0，然后加水稀释至500 mL，得到0.3 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.0)。

标准溶液：准确称取0.200 g(精确至0.001 g)仲丁胺标准品，用乙腈溶解，配成40 g/L的标准储备液，在4 ℃下保存。用乙腈将仲丁胺标准储备液逐级稀释成0.001，0.01，0.05，0.1，1.0 mg/L系列质量浓度的标准溶液。

FMOC衍生溶液：称取25.0 mg FMOC，用乙腈定容至5 mL容量瓶中，浓度为5 g/L，相应低浓度的衍生试剂用乙腈稀释而成。

1.3 样品前处理方法

参考农业行业标准的方法[4]，称取均匀样品25.0 g(精确至0.1 g)于300 mL蒸馏管中，加入35 mL 1 mol/L的 CaCl2溶液、5.0 g MgO与25 mL水，混合均匀。将蒸馏瓶连到自动凯氏定氮仪上进行蒸馏，蒸馏时间为8 min，用装有10 mL 0.15 mol/L 的H2SO4溶液和10 mL蒸馏水的烧杯接收馏出液约150 mL，用0.3 mol/L NaOH溶液将蒸馏液调至pH 7.0，最后用超纯水定容至200 mL备用。

1.4 衍生化方法

准确吸取标准溶液或样品0.2 mL，加入0.3 mL 0.5 g/L衍生试剂及0.3 mL 0.3 mol/L 硼酸盐溶液(pH 8.0)，用乙腈定容至1 mL，涡旋振荡1 min，使其充分反应。10 000 r/min离心5 min，上清液过滤膜供液相色谱测定，测定应在48 h内完成。

1.5 HPLC条件

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为H2O，B为ACN，流速：1.0 mL/min；梯度洗脱程序：0～18 min，10%～95%B；18～22 min，95% B；22～22.1 min，95%～10%B。柱温 30 ℃；进样量 10 μL；紫外检测波长 265 nm。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的优化

2.1.1 衍生剂浓度的影响 为保证检测仲丁胺时衍生化试剂完全过量，在0.30 mol/L硼酸盐缓冲溶液pH值为8.0，反应时间为15 min的条件下，考察了室温下不同浓度FMOC对0.2 mL 0.1 mg/L仲丁胺标准溶液衍生化反应的影响。分别配制0.01，0.05，0.10，0.50，1.00，2.50，5.00 g/L的衍生剂，与仲丁胺标准溶液进行衍生化反应。结果显示，当衍生剂浓度为0.50 g/L时，仲丁胺衍生物色谱峰的峰面积最大，衍生反应最完全，而且氨基酸衍生物的峰形良好。故选择衍生剂的最佳浓度为0.50 g/L。

2.1.2 硼酸盐缓冲溶液pH值的影响 本文选用硼砂溶液作为缓冲溶液，分别考察了0.30 mol/L硼酸盐缓冲溶液的pH值(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0)对仲丁胺衍生化反应的影响。结果表明，当硼酸盐缓冲溶液pH值为7.0，8.0，9.0时，仲丁胺衍生产物的峰面积最高且趋于平缓。同时发现当pH值分别为5.0，6.0，7.0时仲丁胺衍生产物附近会出现1个杂峰，这可能是衍生化反应在pH≤7.0(酸性)条件下会导致产物不够稳定，产生一些副产物，故实验选择硼酸盐缓冲溶液的最佳pH值为8.0。

2.1.3 衍生温度与时间的影响 FMOC的衍生化反应十分迅速，且条件温和，本实验考察了不同反应温度(4，10，室温(20～30 ℃)，40，50，60 ℃)下仲丁胺衍生产物的色谱行为。结果发现，在4 ℃或10 ℃下衍生化样品会析出结晶，而室温(20～30 ℃)，40，50 ℃时，衍生化反应产物一致，峰面积无显著变化且不会析出晶体；当温度为60 ℃时，峰面积会下降，说明高温下反应更倾向于FMOC的水解，因此反应温度过高会导致产物衍生化不完全，衍生化效率降低，测定结果不准确。由于在4～50 ℃条件下均可以进行衍生化反应，故本方法选择室温作为衍生化反应温度。

吸取0.2 mL 0.1 mg/L仲丁胺标准溶液于离心管中，在室温下分别衍生5，10，15，20，25，30 min，考察不同反应时间的影响。结果显示，10 min时衍生产物的峰面积明显高于5 min时衍生产物的峰面积；而10 min后的衍生化反应趋于完全，色谱峰的峰面积无显著变化。综合考虑实验的平行性和重现性，选择最佳衍生化时间为15 min。

2.1.4 衍生产物的稳定性 按照上述优化的衍生条件衍生后进行测定，在室温下考察测定溶液的稳定性，测定时间间隔为1，6，12，24，48，96 h。结果表明，在1～48 h范围内，目标物峰面积的差距很小；而96 h的目标物峰面积约减少4%。为保证检测的准确性，应在48 h内完成实验。

2.2 样品前处理方法的优化

本实验采用全自动凯氏定氮仪代替原始的玻璃蒸馏装置，解决了前处理过程繁琐耗时、操作误差大等缺点，且该装置简便、安全、蒸馏速度快。由于蒸馏时间是影响该方法回收率的主要因素，故考察了凯氏定氮仪的不同蒸馏时间对回收率的影响。结果表明，最初随着蒸馏时间的延长，仲丁胺的回收率逐渐升高，当蒸馏8 min时回收率达到最高值，此后继续延长蒸馏时间，仲丁胺的回收率则有所降低。因此本实验最终选择蒸馏时间为8 min。

2.3 线性范围、检出限与定量下限

采用乙腈将仲丁胺标准储备液逐级稀释成浓度为0.001，0.010，0.050，0.100，1.000 mg/L的系列标准溶液，按照“1.4”方法进行衍生化反应，衍生后分别得到仲丁胺衍生物标准工作溶液。将衍生后的溶液按浓度由低到高依次进样，以仲丁胺的质量浓度(X，mg/L)为横坐标，对应峰面积(Y)为纵坐标，得到校正曲线方程为Y=32 524.7X-4.2，相关系数为0.999 8，结果表明，仲丁胺在0.001～1.000 mg/L范围内线性关系良好。

通过加标实验，在空白基质中添加标准样品，按前述方法进行测定，以3倍信噪比(S/N=3)对应的目标物浓度作为检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)对应的目标物浓度作为定量下限(LOQ)，得到仲丁胺的检出限为0.1 μg/kg，定量下限为0.5 μg/kg。该方法的灵敏度高，可满足样品的测定要求。

2.4 回收率、准确度与精密度

分别选择黄瓜、西红柿、葡萄、橙、梨等作为空白样品，进行0.001,0.01,0.1 mg/kg 3个浓度水平的加标回收实验，每个浓度水平平行6次，结果见表1，空白样品和加标样品的色谱图见图1。仲丁胺在5种果蔬中的加标回收率为82.4%～95.2%，相对标准偏差为1.3%～6.8%。本方法的准确度和精密度均符合残留分析要求，能够满足果蔬中仲丁胺含量的测定要求。

表1 果蔬中仲丁胺的加标回收率及相对标准偏差(n=6)

2.5 实际果蔬样品的分析

采用本文建立的方法，对随机抽样于各农贸市场、超市的果蔬样品进行检测。结果显示，所有样品均未检出仲丁胺。

3 结 论

本文采用全自动凯氏定氮仪代替原有的玻璃蒸馏仪进行蒸馏提取，FMOC作为柱前衍生剂，建立了高效液相色谱测定果蔬中仲丁胺含量的定量分析方法。由分析结果可知，本方法操作简单，灵敏度和稳定性高，检测周期短，可用于果蔬中仲丁胺的测定。

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Determination of 2-Aminobutane in Vegetables and Fruits by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Pre-column Derivatization

ZHOU Rong， CAO Zhao-yun， ZHAO Xiao-hua， LIN Xiao-yan，MOU Ren-xiang*

(Rice Product Quality Inspection and Supervision Center,Ministry of Agriculture,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China)

A high performance liquid chromatographic method with pre-column derivatization was developed for the determination of 2-aminobutane in vegetables and fruits.The sample was distilled with kjeldahl apparatus.The distillate was neutralized with NaOH solution before derivatization with 9-fluorenylemethyl chloroformate(FMOC) as derivatization agent under alkaline condition.The sample was separated on a C18analytical column and detected by HPLC with a UV detector at a wavelength of 265 nm.Systematic investigation was carried out on the dependence of the derivatization conditions such as concentration of derivatization,pH value of borate buffer solution,reaction temperature and time etc.The optimized conditions were as follows:concentration of derivatization:0.50 g/L,pH value of borate buffer:8.0,reaction temperature:room temperature,and reaction time:10 min.Under the optimal conditions,a linear relationship was achieved between the peak area and the concentration of 2-aminobutane in the range of 0.001-1.000 mg/L，with a correlation coefficient of 0.999 8.The recoveries at three spiked levels were in the range of 82.4%-95.2% with relative standard deviations (RSDs) of 1.3%-6.8%.The limit of detection(LOD) was 0.1 μg/kg,and the limit of quantitation (LOQ) was 0.5 μg/kg.With the advantages of rapidness,simplicity,safety,high sensitivity and reproducibility,this method is suitble for the determination of 2-aminobutane in vegetables and fruits.

pre-column derivatization;high performance liquid chromatography (HPLC);kjeldahl apparatus;2-aminobutane;vegetables and fruits

2017-02-10；

2017-02-28

浙江省科技计划项目(2015C37057)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.013

O657.72；S482.2

A

1004-4957(2017)06-0778-05

*通讯作者：牟仁祥，副研究员，研究方向：农产品标准与检测技术，Tel：0571-63370275，E-mail：mourx@hz.cn