新多聚糖碳酸氢盐腹膜透析液对人腹膜间皮细胞凋亡及纤维化相关因子的影响

胡 波 龚文玉 尹良红 祝 琳

新多聚糖碳酸氢盐腹膜透析液对人腹膜间皮细胞凋亡及纤维化相关因子的影响

胡 波1龚文玉1尹良红1祝 琳2

目的：比较新研制的多聚糖碳酸氢盐腹膜透析液(PDF)与常用乳酸盐PDF对人腹膜间皮细胞(HPMC)凋亡及间质纤维化相关因子的影响。 方法：体外培养HPMC细胞，使用新型PDF与不同葡萄糖浓度的传统乳酸盐PDF(1.5%、2.5%、4.25%)处理细胞，通过实时荧光定量PCR法检测细胞凋亡因子Bax、胱天蛋白酶3(Caspase-3)及Bcl-2、转化生长因子β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)的mRNA表达量，ELISA法测定细胞分泌TGF-β1量，免疫印迹法检测细胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3、抑制凋亡蛋白Bcl-2和FN的表达量。 结果：不同PDF刺激HPMC细胞一定时间后，1.5%、2.5%、4.25%传统PDF中葡萄糖浓度越高，Bax、Caspase-3、TGF-β1和FN增高越明显，抑制凋亡因子Bcl-2下降越显著,而新型PDF影响较小。含2.5%、4.25%葡萄糖的PDF刺激后，纤维化相关因子TGF-β1、FN明显高于阴性对照组和新型PDF组(均P<0.05)。 结论：新型多聚糖碳酸氢盐PDF对腹膜间皮细胞凋亡信号活化低于传统乳酸盐PDF，其腹膜间皮细胞纤维化程度低，有很好的临床应用前景。

腹膜透析液 腹膜间皮细胞 细胞凋亡 腹膜纤维化

腹膜透析(PD)是终末期肾病(ESRD)患者有效的治疗方法之一。目前国内市面上在售的腹膜透析液(PDF)以葡萄糖为溶剂的，包括1.5%、2.5%和4.25%三种浓度，并以乳酸盐作为缓冲碱。乳酸盐吸收进入体内后必须经过肝脏代谢为碳酸氢根才能发挥纠正代谢性酸中毒的生理作用，因此不适合用于肝脏功能障碍患者。生理性较理想的缓冲碱基为碳酸氢盐，乳酸盐和醋酸盐都是非生理性缓冲碱。人腹膜间皮细胞(HPMC)是腹膜组织中最主要的功能细胞和结构细胞，HPMC在腹膜纤维化过程中起着非常重要的作用。在腹膜纤维化早期，我们可以观察到肥大的腹膜间皮细胞呈现细胞早衰的特征[1]。发生衰老的间皮细胞将慢慢出现凋亡或死亡，可引起腹膜间皮细胞的脱落，同时腹膜间皮细胞过多的凋亡可导致腹膜细胞外基质增生，从而导致腹膜抵御纤维化的能力下降，最终因腹膜过早出现纤维化引起超滤衰竭。研发新型的减少HPMC细胞凋亡及纤维化的PDF成为目前的研究热点。

在目前众多凋亡信号的研究中，胱天蛋白酶(Caspase)家族、Bax及Bcl-2蛋白家族是目前最受关注的三种凋亡调控基因[2-3]。Bax、Caspase是凋亡基因，Bcl-2是凋亡抑制基因,Bax和Bcl-2是目前已知的一对重要调控基因，且在凋亡调控过程中的功能是相互对立的。大量临床和基础研究显示，长期暴露在非生物相容性的PDF中，在大量细胞因子和炎症因子的共同作用下可导致腹膜发生慢性炎症反应，包括转化生长因子β1(TGF-β1)和纤维连接蛋白(FN)[4-6]，可导致腹膜纤维化病变的发生，而且这种病变以FN沉积为特征[7]。

本文通过比较新研制的多聚糖碳酸氢盐PDF与常用乳酸盐PDF对HPMC凋亡及间质纤维化相关因子的影响，为研制新型PDF提供实验依据。

实验材料和方法

主要试剂 M199培养基，胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)；100×链霉素和青霉素(美国Invitrogen公司)；胰蛋白酶、转铁蛋白(美国Sigma公司)；十二烷基硫酸钠(SDS)(美国Sigma-Aldrich公司)；RNA提取试剂Trizol (美国Invitrogen公司)，引物由上海生工公司合成；SYBR® Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) kit(大连宝生物公司)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(大连宝生物公司)；human TGF-β1预包被ELISA kit(北京达科为公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)；BeyoECL Plus化学发光试剂盒(上海碧云天公司)；Caspase-3、Bax、Bcl-2、FN和β-tubulin单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠二抗(美国Cell Signaling Technology公司)。新型PDF(本实验室研制)、传统PDF(广州百特医疗用品有限公司)成分见表1。

表1 腹膜透析液(PDF)的成分

*：葡萄糖浓度分别为1.5%、2.5%、4.25%

HPMC的分离培养和鉴定 充分征得患者知情同意后，取无肾病患者腹部手术时大网膜切除标本，摘除血管和脂肪组织，用无菌的PBS(pH=7.3)清洗网膜3次，然后将其剪成碎块，按文献方法分离获得HPMC，然后用含10 % (v/v)胎牛血清，青霉素(100 U/ml)，链霉素(100 μg/ml)，氢化可的松(0.4 μg/ml)，L-谷氨酰胺(2 mmol/L)的M199完全培养基培养HPMC。调整细胞密度为1×105/ml，滴管吹打均匀，接种到0.1%明胶包被的25 cm2培养瓶中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，每2 d换1次培养基。当细胞生长1～2周融合至单层时，用PBS洗培养瓶2次，加1 ml含EDTA的胰酶在37℃消化10～15 min，然后加3 ml含10 %胎牛血清的M199培养基终止消化，将细胞悬液收集于离心管，4℃ 200 ×g离心5 min，再用含10 %胎牛血清M199重悬细胞并调整细胞数为1×105/ml，接种到培养瓶中。传代细胞经倒置相差显微镜观察，免疫组化鉴定抗细胞角蛋白抗体阳性，抗波形蛋白染色阳性，抗VIII因子抗体阴性，抗白细胞CD45抗体染色阴性，已鉴定的第3代HPMC用于实验。

实时荧光定量PCR检测HPMC凋亡和分化相关蛋白mRNA表达 取HPMC以1×105/ml接种于6孔板，每孔含培养基2 ml。细胞分为五组：(1)对照组(M199培养基)；(2)7.5%新PDF组；(3)1.5%PDF组；(4)2.5%PDF组；(5)4.25%PDF组，后三组为含不同葡萄糖浓度的传统透析液。干预作用6 h。Real time PCR法检测凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Bcl-2及纤维化相关基因TGF-β1、FN的相对表达量。

qPCR实验步骤：抽提总RNA，测总RNA浓度和检测其完整性，去除基因组DNA。打开Bio-Rad CFX Connect仪器盖，放入样品，开始运行程序，反应程序为：(1)预变性94℃ 2 min，(2)变性94℃ 30s，(3)退火58℃ 30s，(4)延伸72℃ 30s，(5)读板；第(5)步完成后又回到第(2)步，循环39次。绘制溶解曲线，95℃ 15s，然后从60℃向95℃每0.5℃升温，时间间隔5 s，记录一次荧光值。运行完毕后，取出样品，按关闭Bio-Rad CFX Manager 3.0软件、PCR仪电源开关。基因表达的相对定量用2-ΔΔCt法分析。

表2 所需引物

Bcl-2:B淋巴细胞瘤2基因;Bax:Bcl-2相关x蛋白质;Caspase-3:胱天蛋白酶3；TGF-β1:转化生长因子β1；FN：纤维连接蛋白；β-actin:β肌动蛋白

酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞培养液中TGF-β1蛋白质含量 细胞分组同上，不同PDF干预24h、48h后，收集培养细胞的上清，利用双抗体夹心法检测共培养体系中TGF-β1的蛋白水平。实验开始前按照标签说明书配置所需试剂；加样，用密封条密封孔板，室温孵育2h；倒弃孔内液体，加洗涤液，重复3次；加稀释好的检测抗体，密封孔板，室温孵育2h；洗板，重复3次；每孔加100 μl链霉亲和素-HRP，密封孔板，轻轻振荡混匀，室温孵育30 min；洗板，重复3次；每孔加入 100 μl的过氧化酶底物(TMB)，避光孵育10～20 min；每孔加入 100 μL终止液终止反应，溶液颜色会从蓝色变为黄色。10 min内用450 nm(参考波长630 nm)测OD值。

Western blot法鉴定不同PDF对HPMC凋亡和转分化相关蛋白的影响 实验分组同上，不同PDF处理细胞24 h，制备蛋白样品，然后用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax，Caspase-3，Bcl-2及转分化相关蛋白FN的表达量。

加入适量细胞裂解液后，收集蛋白样品，继续试验或冻于-80℃备用。参照二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )试剂盒(碧云天)试剂盒说明书进行蛋白定量检测。Western blotting法分析蛋白样品，首先配制SDS-聚丙稀酰胺凝胶，蛋白上样，打开电泳仪电源，溴酚蓝距胶下缘沿约0.5 cm处(45 min左右)停止。将蛋白电转移至PVDF膜上，电转移完毕后，将膜浸没于封闭液中缓慢摇荡1 h。加入稀释好的一抗，4℃慢摇过夜，取出膜用PBST浸洗三次。加入二抗，在摇床上室温轻摇1 h，倒掉二抗用PBST浸洗膜三次。将A液和B液按1∶ 1体积配制成ECL反应底物，作用2 min后吸去发光液，将膜用透明无色塑料薄膜包裹后置于暗盒。在暗室中，将X光片置于膜上，暗盒夹紧后曝光适当时间，曝光后的胶片在显影液中显影。FluorChem8000成像仪(AlphaInnotech)拍摄显影结果，最后用AlphaEaseFC软件进行灰度分析。目的蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值，比值即为所测蛋白的相对含量。

统计学处理 采用统计软件SPSS19.0进行统计分析。计量资料均以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验或者One-Way ANOVA分析，组内比较使用配对样本t检验，以a=0.05作为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结 果

qPCR检测Bax，Caspase-3，Bcl-2，TGF-β1，FN基因的表达水平 凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2和转分化相关蛋白TGF-β1、FN的RNA相对表达量结果见图1。与对照组比较，2.5%和4.25% PDF组的凋亡基因Bax、Caspase-3的mRNA表达量显著增加(P<0.01)，凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表达量显著减少(P<0.01)，有一定的葡萄糖剂量依赖性。7.5% 新型PDF组Bax、Caspase-3的mRNA表达量与2.5%和4.25%PDF组比较显著减少(P<0.01)，而Bcl-2的mRNA表达量明显增加(P<0.05)，结果表明新型PDF能有效减弱透析液引起的HPMC凋亡相关基因的活化。

图1 不同PDF对HPMC凋亡和转化相关基因的影响PDF：腹膜透析液；TGF-β1：转化生长因子β1；FN：纤维连接蛋白；直方图为各个基因mRNA的相对表达量，以对照组为参照；n=3，*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

7.5%新型 PDF组TGF-β1、FN的mRNA表达量与对照组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。1.5%、2.5%、4.25% PDF组TGF-β1、FN的mRNA表达量呈葡萄糖剂量依赖性的增加，2.5%、4.25%葡萄糖浓度PDF的TGF-β1、FN相对表达量较新型PDF显著上升，有统计学意义(P<0.01)，结果表明新型PDF对HPMC细胞纤维化相关基因激活能力低。

ELISA法测定细胞培养液中TGF-β1蛋白表达量 不同PDF处理HPMC 24h和48h后，细胞分泌TGF-β1的蛋白量结果如图2所示，2.5%和4.25% PDF作用24 h时，TGF-β1表达量显著高于对照组，与7.5%新型PDF组比也明显升高(P<0.05)。作用48h时，1.5%、2.5%、4.25% PDF呈现递增式趋势的上调TGF-β1，且表达量显著高于7.5%新型PDF组，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明新型PDF对腹膜间皮细胞的转分化激活较小。

图2 PDF作用24h(A)、48h(B)后TGF-β1蛋白分泌量分析直方图PDF：腹膜透析液；TGF-β1：转化生长因子β1；n=3，*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

Western blot检测Bax，Caspase-3，Bcl-2，FN的蛋白表达水平 免疫印迹法分析凋亡相关蛋白Bax，Caspase-3，Bcl-2，及纤维连接蛋白FN表达量及灰度分析结果见图3。与对照组比较，传统PDF组Bax、Caspase-3、FN的蛋白表达量呈葡萄糖剂量依赖性的显著增加(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表达量显著减少(P<0.01)。与对照组比较，7.5%新型PDF组Bax、Caspase-3、Bcl-2、FN的蛋白表达无差异性(P>0.05)。7.5% 新型 PDF组Bax、Caspase-3、FN的蛋白表达量明显低于传统PDF组(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表达量显著高于传统PDF组(P<0.01)。免疫印迹分析结果与基因水平结果相符，表明新型PDF对HPMC细胞凋亡蛋白Bax、caspase-3的活化较小，使凋亡抑制蛋白Bcl-2保持正常表达水平，新型PDF有利于防止PD引起HPMC凋亡和纤维化的激活。

图3 免疫印迹法分析凋亡和分化相关蛋白Caspase-3:胱天蛋白酶3；PDF：腹膜透析液； FN：纤维连接蛋白；β-tubulin:β微管蛋白；A：Bax、Caspase-3、Bcl-2凋亡蛋白的显影图和灰度分析直方图；B：FN蛋白的显影图和灰度分析直方图，n=3，**:P<0.01;***:P<0.001

讨 论

腹膜纤维化是导致PD超滤衰竭的重要原因之一，本研究及既往的很多研究均表明，传统乳酸盐PDF尤其是高葡萄糖浓度乳酸盐PDF可导致HPMC分泌产生大量致腹膜纤维化因子，逐渐导致腹膜纤维化及腹膜超滤衰竭的发生[8]。腹膜间皮细胞的生理功能主要为防御腹腔局部炎症发生，促进溶质转运、超滤体内多余水分，同时HPMC在预防腹膜纤维化的方面也发挥着非常重要的作用[9-10]。鉴于目前市面上PDF生物相容性较差，研发一种生物相容性较高的更合乎生理状态的PDF成为目前的研究热点。生物相容性高的PDF可减少腹膜间皮细胞的损伤，促进其增殖修复，从而提高PD质量和延长PD时间[11]。

早在90年代初，多聚糖PDF已在国外临床上出现，目前发达国家常用的多聚糖透析液为艾考糊精透析液。艾考糊精是水溶性葡萄糖聚合物，分子量大，超滤能力强，改善容量平衡，尤其适用于腹膜高转运和超滤功能较差的患者；因其超滤过强容易损伤腹膜功能，并仍以乳酸盐为缓冲碱，生物相容性欠佳。本实验室研制的新型PDF在支链玉米淀粉中加入盐酸后水解得到多聚糖，缓冲剂为碳酸氢盐，其pH值可存在于正常生理范围内，增加其生物相容性。多聚糖及离子成分与碳酸氢盐分别置于双腔袋的各腔，作用于HPMC细胞时才混合，避免形成碳酸钙沉淀。

Boulanger等[12]通过使用不同浓度的葡萄糖透析液培养HPMC，发现HPMC的凋亡率与透析液葡萄糖浓度成正比[11-12]。本研究亦发现加入高糖PDF后，HPMC凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组，抑制凋亡因子Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组，表明高糖PDF可能激活腹膜间皮细胞凋亡信号。

研究显示传统PDF组较对照组细胞凋亡因子Bax、Caspase-3表达增多，抑制凋亡因子Bcl-2表达降低[13]。本实验室研制的新型PDF与传统葡萄糖乳酸盐PDF(1.5%，2.5%，4.25%)相比，细胞凋亡因子Bax、Caspase-3表达显著减少，抑制凋亡因子Bcl-2表达显著增多。新型PDF可能通过调节凋亡相关基因Bax/Bcl-2的比值，维持细胞线粒体膜的通透性和结构完整，抑制细胞色素C释放，调节凋亡效应分子如Caspase-3等的活性，达到抑制腹膜间皮细胞凋亡的作用及减少腹膜细胞外基质增生和纤维化的作用。

本研究发现，在高浓度葡萄糖PDF作用下，HPMC的TGF-β1、FN的mRNA和蛋白质表达量较对照组明显增加，表明高浓度葡萄糖PDF能诱导HPMC纤维化相关因子表达，从而诱导腹膜纤维化的发生。而使用新型PDF后，FN的mRNA表达量显著降低，提示新型PDF具有潜在抑制HPMC纤维化的作用。

综上所述，本实验结果表明相比传统葡萄糖乳酸盐PDF，新型多聚糖碳酸氢盐PDF对腹膜间皮细胞凋亡信号活化低，其腹膜间皮细胞纤维化程度低，为临床新型PDF研发提供了新的理论依据，有很好的临床应用前景，其具体作用机制有待进一步研究。

2 Kuwana T,Newmeyer DD.Bcl-2-family proteins and the role of mitochondria in apoptosis.Curr Opin Cell Biol,2003,15(6):691-699.

3 Saed GM,Jiang Z,Fletcher NM,et al.Modulation of the bcl-2/bax ratio by interferon-gamma and hypoxia in human peritoneal and adhesion fibroblasts.Fertil Steril,2008,90(5):1925-1930.

4 Zhang J,Tian XJ,Zhang H,et al.Tgf-beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition proceeds through stepwise activation of multiple feedback loops.Sci Signal,2014,7(345):ra91.

5 Bajo MA,Pérez-Lozano ML,Albar-Vizcaino P,et al.Low-gdp peritoneal dialysis fluid (“balance”) has less impact in vitro and ex vivo on epithelial-to-mesenchymal transition (emt) of mesothelial cells than a standard fluid.Nephrol Dial Transpl,2011,26(1):282-291.

6 Sabatier L,Chen D,Fagotto-Kaufmann C,et al.Fibrillin assembly requires fibronectin.Mol Biol Cell,2009,20(3):846-858.

7 Aroeira LS,Aguilera A,Selgas R,et al.Mesenchymal conversion of mesothelial cells as a mechanism responsible for high solute transport rate in peritoneal dialysis:Role of vascular endothelial growth factor.Am J Kidney Dis,2005,46(5):938-948.

8 Weiss L,Stegmayr B,Malmsten G,et al.Biocompatibility and tolerability of a purely bicarbonate-buffered peritoneal dialysis solution.Perit Dial Int,2009,29(6):647-655.

9 Lai KN,Tang SC,Leung JC.Mediators of inflammation and fibrosis.Perit Dial Int,2007,27( Suppl 2):S65-71.

10 Yung S,Chan TM.Pathophysiological changes to the peritoneal membrane during pd-related peritonitis:The role of mesothelial cells.Mediators Inflamm,2012,2012:484167.

11 Qi H,Xu C,Yan H,et al.Comparison of icodextrin and glucose solutions for long dwell exchange in peritoneal dialysis:A meta-analysis of randomized controlled trials.Perit Dial Int,2011,31(2):179-188.

12 Boulanger E,Wautier MP,Gane P,et al.The triggering of human peritoneal mesothelial cell apoptosis and oncosis by glucose and glycoxydation products.Nephrol Dial Transplant,2004,19(9):2208-2216.

13 崔明姬,王芳,顾春梅,等.乳酸盐腹膜透析液对人腹膜间皮细胞凋亡及bcl-2、bax表达和caspase-3活性的影响.吉林大学学报(医学版),2009,35(3):470-473.

(本文编辑 律 舟)

The effect of the new polysaccharide bicarbonate peritoneal dialysis fluid on apoptosis and fibrosis of peritoneal mesothelial cells

HUBo1,GONGWenyu1,YINLianghong1，ZHULing2

1DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospitalofJINANUniversity,Guangzhou510630,China2DepartmentofOutpatient,TheFirstAffiliatedHospitalofJINANUniversity,Guangzhou510630,China

ZHULing(E-mail:hubo26@foxmail.com)

Objective：To compare the influence of new polysaccharide bicarbonate peritoneal dialysis fluids (PDF) on the human peritoneal mesothelial cells (HPMC) apoptosis and interstitial fibrosis factors. Methodology：Human peritoneal mesothelial cells (HPMC) were cultured in vitro，then treated with the new PDF and traditional PDF with different concentration of glucose (1.5%,2.5%,4.25%). Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of apoptotic factors Bax,Caspase-3 and apoptosis inhibition factor Bcl-2,TGF-β1 and FN. ELISA determined the secretion of TGF-β1 expression,western blot was used to detect apoptosis protein Bax,Caspase-3,apoptosis inhibition proteins Bcl-2 and FN. Results：After a certain time of stimulation on HPMC,the higher the glucose concentration (1.5%、2.5%、4.25%) of traditional PDF,Bax,Caspase-3,TGF-β1,FN increased more significantly,apoptosis inhibition factor Bcl-2 decreased more significantly. After stimulation with 2.5%,4.25% PDF,fibrosis related factor TGF-β1 and FN were much higher than that of the negative control group and new PDF group (P<0.05). Conclusion：The new polysaccharide bicarbonate peritoneal dialysis fluid is superior to the traditional peritoneal dialysis fluid,its effect on the apoptosis protein of peritoneal mesothelial cells is weaker than that of the traditional peritoneal dialysis fluid,peritoneal mesothelial cell fibrosis degree is aslo lower,which has good prospects for clinical application.

peritoneal dialysis fluid peritoneal mesothelial cells apoptosis peritoneal fibrosis

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.01.008

广东高校工程技术研究(开发)中心计划(GCZX-A1104)

1暨南大学附属第一医院肾脏内科(广州，510630)，2门诊部

祝 琳(E-mail:hubo26@foxmail.com)

2016-08-22

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