循环牵张应力下BMSCs非接触共培养对人退变纤维环细胞增殖及蛋白表达的影响

2017-06-29李爽孙晓雷马信龙张杨邓树才郝永宏

天津医药 2017年6期

李爽，孙晓雷，马信龙△，张杨，邓树才，郝永宏

李爽1，孙晓雷1，马信龙1△，张杨2，邓树才1，郝永宏1

目的比较不同大小循环牵张应力对共培养状态下人退变纤维环细胞增殖与蛋白表达的影响。方法取手术摘除的腰椎间盘突出症患者椎间盘，病理学方法对其退变程度进行分级，选取其中退变纤维环组织。酶消化法分离纤维环细胞，选取P3代细胞，与术中获得的骨髓基质干细胞（BMSCs）进行非接触式共培养。利用ElectroForce3200力学试验仪搭载的BioDynamic生物反应器系统，以3 h为固定时间点对其进行不同大小的频率为0.25 Hz的周期性牵张应力刺激，设置形变量分别为0、5%、10%、15%和20%，同时设定无共培养的纤维环细胞为对照组。应用流式细胞仪检测不同应力刺激下2种纤维环细胞的增殖情况，Real-Time PCR方法检测人退变纤维环细胞对蛋白多糖和Ⅰ型胶原的表达情况。结果在相同应变刺激下，共培养组细胞的细胞增殖指数（PI）值、S期细胞比例、Ⅰ型胶原、蛋白多糖的表达量均高于对照组（P＜0.05）。退变组细胞PI值、S期细胞比例、Ⅰ型胶原、蛋白多糖的表达量最高值出现在10%形变刺激下，而共培养组上述指标中除S期细胞比例峰值出现在10%形变刺激下以外，其余各指标峰值均出现在15%形变刺激下。结论BMSCs的非接触共培养对人退变纤维环细胞增殖及蛋白表达存在正向调节作用，且该调节作用受到力学环境的影响。

椎间盘移位；细胞,培养的；细胞增殖；椎间盘退变；循环牵张应力；纤维环细胞；共培养；骨髓基质干细胞

IVDD）是腰椎间盘突出症等一系列脊柱退行性疾病的病理学基础，其主要病理改变为椎间盘细胞数量减少及椎间盘基质的蛋白多糖的结构、功能、含量和类型的变化［1］。椎间盘纤维环部分的脱水变性是腰椎间盘突出的早期病理学表现，而纤维环退变的基础则是各种物理化学因素导致的纤维环细胞（annulus fibrosus cells，AFCs）增殖及蛋白表达的改变。因此，对IVDD的早期干预已经成为细胞学治疗的重要目标［2-3］。骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）作为具有多种分化潜能的干细胞，对人体退变椎间盘细胞具有一定的激活作用。

大量研究认为，BMSCs移植治疗可减缓椎间盘的退变［4-5］，在重建和恢复椎间盘生物学功能方面显示出一定的潜能［6-9］。本研究将人退变AFCs与同种异体

BMSCs在力学环境下进行共培养，通过观察力学环境下BMSCs对人退变AFCs增殖与蛋白表达的作用，探讨干细胞治疗腰椎间盘退变的机制。

1 材料与方法

1.1 材料患者椎间盘标本1例（天津市天津医院手术室），高糖DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司），D-hank’s液（自制），单克隆兔抗人Ⅰ型胶原一抗、山羊抗兔二抗、SABC试剂盒（博士德公司），倒置相差显微镜（Olympus公司），ElectroForce3200力学试验仪、BioDynamic生物反应器系统（Bose公司，USA），Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、EDTA（Sigma公司），细胞培养皿（Corning公司），CO2细胞培养箱（Heraeus公司），流式细胞仪以及相关分析软件（BC公司），Real-Time PCR相关试剂及设备（康成公司，上海）。

1.2 AFCs的取材以及分离培养取天津市天津医院脊柱外科1例手术患者（女性，38岁，L4～5间盘突出症患者）间盘，术前经患者知情并同意。依照经典参考文献［10］，根据标本椎间盘和髓核的界限、裂隙出现情况、蛋白多糖表达和细胞集群生长情况对患者椎间盘的退变情况进行评分与分级，样本评分为11分，为严重退变椎间盘。

1.3 人 BMSCs的分离培养根据参考文献［11］方法，BMSCs取自天津市天津医院脊柱外科手术患者（男性，48岁，L4椎体滑脱伴腰椎管狭窄症）的椎弓根通道。无菌条件下，用含0.01%肝素的D-hank’s液稀释后移入离心管中，以2 500 r/min离心15 min，弃上清液。剩余组织加入不含血清的高糖DMEM培养基混匀，取6 mL混合液叠加于3 mL Ficoll淋巴细胞分离液上，继续以2 500 r/min常温离心15 min。无血清DMEM/F12培养基洗涤2次，收集骨髓基质干细胞种于培养瓶内，加入含10%FBS的高糖DMEM培养基，于37℃、5%CO2恒温箱中培养。

1.4 共培养通过Transwell方法将所得的P3代人退变AFCs与P3代人BMSCs进行共培养（共培养组）。BMSCs种植于孔径3 μm的半透膜上，下层种植AFCs，2种细胞之间互不接触，仅以培养液连通。2种细胞比例为1∶1。相差显微镜下观察细胞形态。同时设立无BMSCs共培养的AFCs作为对照（退变组）。

1.5 对AFCs加载单轴周期性牵张应力

1.5.1 加载装置本研究采用美国Boss公司BioDynamic生物反应器系统，以弹性基底膜（Dow Corning公司）作为载体［12］，配合EletroForce3200控制系统对细胞进行应力加载，由Bose PCI和Win Testing系统联合控制力学参数，如持续时间、拉伸长度、拉伸频率等，使弹性基底膜产生精准变形，使培养在上面的细胞同时受到拉伸形变的作用。细胞所受力值大小由弹性基底膜拉伸形变率（%）表示。

1.5.2 共培养状态下周期性牵张应力加载自行设计共培养力学加载系统，见图1。将体外培养的P3代AFCs以及P3代BMSCs制成密度为2×105/mL的共2 500 μL的细胞悬液（2种细胞数量比例为1∶1），分别接种于10张硅胶载体上，每张接种500 μL，继续培养24 h，贴壁后用于实验（此时细胞密度长满80%左右）。将膜片固定后置于BioDynamic生物反应器中进行力学加载。

根据本课题组前期实验结果［13］，按照加载力的大小将所得细胞分为5组，每组6个样本，分别加载0、5%、10%、15%以及20%形变量，以0.25 Hz的频率加载3 h。培养基储液罐置于37℃、5%CO2培养箱中，由管道和反应器相连。蠕动泵以15 mL/min的速度使培养基在整个系统中缓慢循环，以保证加载过程中反应仓内稳定的CO2浓度和温度。细胞加载3 d后用于后续实验。

Fig.1 The co-culture CTS system图1 共培养力学加载系统

1.6 流式细胞技术检测细胞增殖率用0.05%胰蛋白酶分别消化并收集2组AFCs，1 000 r/min离心5 min，弃上清后用无菌D-hank’s液漂洗2次，然后加入4℃预冷的D-hank’s液1 mL，轻轻吹打制成单细胞悬液。加入4℃预冷的无水乙醇3 mL固定（使乙醇最终浓度变为75%），4℃保存。18 h后离心弃固定液，经10 mg/L RNA酶和0.1%Triton X-

100处理30 min后，10 mg/L碘化丙啶染色，以流式细胞仪检测细胞周期，CFlow Plus软件处理数据。根据细胞周期中G0～G1期和 G2～M 期细胞比例（%）计算 S期细胞比例（%），进而计算细胞增殖指数（proliferative index，PI）。

1.7 Real-Time PCR检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原mRNA的表达取共培养力学加载3 d后2组AFCs，弃上清，分别提取各组细胞RNA，反转录为cDNA。通过Real-Time PCR对蛋白多糖、Ⅰ型胶原mRNA进行扩增，β-actin作为内参，引物序列见表1。反应体系20 μL，包括上、下游引物各0.5 μL，模板 1.0 μL，SYBR MIX 10 μL，水 8.0 μL。Real-Time PCR反应步骤为95℃20 s，95℃5 s，60℃20 s，重复40个循环，采用3复孔检测并取CT平均值。用2-△△CT计算目的基因的相对表达量。共培养实验单独重复3次。

目前布病所引起的肝功能异常以积极抗菌药物治疗同时联合保肝治疗[34]。利福平有肝毒性，使用时定期复查肝功能及腹部超声。对肝功能明显受损者，避开利福平的组合方案，可选择替代方案多西环素+左氧氟沙星和多西环素+第三代头孢类菌素。

Tab.1 Primer sequences used in the real-time polymerase chain reaction analysis表1 Real-Time PCR中引物序列

Fig.2 Phase-contrast photomicrographs of primary cultured AFCs and BMSCs（×100）图2 相差显微镜下AFCs及BMSCs（×100）

Fig.3 The cellular morphology pictures of AFCs after different CTS（×100）图3 不同大小力学刺激后AFCs形态（×100）

1.8 统计学方法采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，不同力学加载组间比较采用单因素方差分析，多重比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人退变AFCs及BMSCs的培养 AFCs接种后约1周左右长满瓶底。处于生长期的细胞形态主要为椭圆、梭形或多角形，呈软骨样或成纤维样，集落状排列，见图2A。BMSCs接种后约24～48 h开始贴壁，细胞形态由圆形变成长梭形、多角形，旋涡样生长，约1周左右长满瓶底，见图2B。

2.2 形态学变化无形变刺激时，共培养组和退变组细胞的形态无明显差异；在10%形变组AFCs形态饱满，折光性强，增殖旺盛；20%形变刺激下，细胞形态不规则，局部有脱落现象，见图3。

2.3 流式细胞仪分析细胞周期结果 0～20%力学加载时，在相同力学刺激下，共培养组S期细胞比例、PI均高于退变组（P＜0.05或P＜0.01）。退变组和共培养组S期细胞比例均为10%形变量时最高，与其余形变量时比较差异均有统计学意义；退变组PI值中以10%形变量时最高，共培养组PI值以15%形变量时最高，与其余形变量时比较差异均有统计学意义，见表2。

2.4 蛋白多糖及Ⅰ型胶原酶表达情况 0～20%力学加载时，在相同力学刺激下，共培养组蛋白多糖、Ⅰ型胶原表达量均高于退变组（P＜0.05或P＜0.01）。退变组蛋白多糖为10%形变量时最高，共培养组为15%形变量时最高，与其余形变量时比较差异均有统计学意义；退变组Ⅰ型胶原表达量以10%形变量时最高，共培养组以15%形变量时最高，与其余形变量时比较差异均有统计学意义，见表3。

Tab.2 Comparison of the proportion of AF cells in the period of DNA synthesis and PIafter different CTS between two groups表2 不同力学刺激后2组AFCs S期细胞比例、PI变化比较（n=6，%，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;a与形变量0比较，b与形变量5%比较，c与形变量10%比较，d与形变量15%比较，P＜0.05；表3同

形变量0 5%10%15%20%F S期细胞比例PI退变组1.82±0.13 2.54±0.18a2.82±0.13ab2.23±0.14abc1.34±0.08abcd105.245＊＊共培养组2.02±0.11 2.87±0.16a3.09±0.14ab2.91±0.11ac2.42±0.13abcd65.822＊＊t t 2.738＊3.321＊3.416＊9.038＊＊17.117＊＊退变组17.03±0.35 21.77±0.98a25.37±1.10ab22.39±1.10abc18.93±0.82abcd75.134＊＊共培养组19.86±0.30 24.05±1.42a31.04±1.50ab32.57±1.58abc25.63±1.06abcd102.057＊＊15.025＊3.245＊7.492＊＊12.994＊＊12.251＊＊

Tab.3 The expressions of aggrecan and collagenⅠin AFCs after different CTS in two groups表3 不同力学刺激后2组AFCs蛋白多糖及Ⅰ型胶原表达量变化（n=6，±s）

形变量0 5%10%15%20%F蛋白多糖Ⅰ型胶原退变组0.42±0.02 0.61±0.04a1.04±0.02ab0.73±0.02abc0.28±0.02abcd960.538＊＊共培养组0.73±0.02 0.82±0.02a1.32±0.02ab1.58±0.02abc0.57±0.02abcd464.703＊＊t t 24.855＊＊8.000＊＊19.500＊＊68.152＊＊23.252＊＊退变组0.52±0.05 0.73±0.02a1.30±0.03ab1.12±0.05abc0.27±0.05abcd352.917＊共培养组0.71±0.03 1.28±0.03a1.93±0.07ab2.56±0.06abc0.65±0.07bcd628.893＊5.731＊＊26.421＊＊30.660＊＊9.733＊＊7.867＊＊

3 讨论

已知IVDD是一种由生物力学和生物化学因素相互作用引起的复杂病理过程［14］。正常的椎间盘组织在体内处于相对稳定的应力环境之中，生理环境下的应力刺激对细胞增殖以及功能表达具有重要的调节作用。当椎间盘所处的力学环境急剧改变，破坏其原有的稳定环境并达到失代偿状态时，间盘细胞表达细胞外基质减少，进一步加重细胞承受的负荷。这种结构与功能的恶性循环可最终导致椎间盘退变［15］。以干细胞移植为基础治疗椎间盘退变的生物学方法主要是通过向目标组织移植干细胞，增加椎间盘细胞的增殖，促进其蛋白多糖及细胞外基质的分泌，打破恶性循环，从而达到延缓甚至逆转椎间盘退变的目的。

BMSCs因其获得容易、增殖能力较强、免疫原性低等特点，被认为是细胞治疗和组织工程理想的种子细胞［16］。已有学者应用BMSCs与退变AFCs进行体外非接触式共培养，发现前者对后者的功能表达可产生相应调节作用，主要体现为蛋白多糖、Ⅰ型胶原以及基质金属蛋白酶等产物表达量的升高［11］。同时，已有研究证实，人退变AFCs的增殖与所施加机械刺激的大小存在剂量依赖性［13］，且机械刺激对体外培养椎间盘细胞表达产物的代谢水平存在影响［17-18］。本文将2种刺激方式相结合，即在对人退变AFCs施加干细胞生物学干预的同时，体外模拟力学环境，观察2种细胞在共培养状态下的增殖及功能表达情况。结果显示，在相同应变刺激下，共培养组细胞的PI值、S期细胞比例、Ⅰ型胶原、蛋白多糖的表达量均高于退变组，说明在相同力学刺激下，BMSCs的引入对退变AFCs的增殖与表达均存在正向调节作用。在形变初期（5%～10%），2组细胞的增殖及表达能力随着力学强度的加载而呈现缓慢上升趋势，并在10%～15%逐渐达到各自峰值，表现出较强的增殖和表达能力，直至当形变强度增加至20%时，退变组与共培养组的增殖能力及蛋白表达均明显下降，最终由对力学环境的代偿转化为失代偿。而2组细胞所承受的最佳力学刺激并不相同则可能意味着BMSCs的引入增加了AFCs对“恶性”力学刺激的耐受程度。

由于Ⅰ型胶原和蛋白多糖是人椎间盘纤维环组织的主要细胞外基质，其含量的增加可对内在的AFCs起到一定的保护作用。BMSCs促进退变AFCs增殖及相关基因上调表达的机制可能为：（1）在共培养过程中，BMSCs可上调合成多种营养因子并通过旁分泌作用使其进入周围微环境，包括转化生长因子（TGF）β1、胰岛素样生长因子（IGF）-1、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）以及骨形态发生蛋白（BMP）-7等，其作用机制包括营养以及减少细胞凋亡等［19］。（2）BMSCs可减少退变 AFCs的凋亡。研究显示，AFCs的凋亡过度是导致椎间盘退变的重要原因之一［20］，退变AFCs在下调Bax表达的同时上调凋亡抑制基因 Bcl-2 的表达［21］。（3）退变AFCs与牵张应力同时作用于外源性BMSCs，以微环境诱导干细胞向软骨样细胞分化，两者的协同作用最终增加了AFCs的数量及其细胞外基质的分泌。（4）适当的循环牵张应力本身可通过激活肌动蛋白细胞骨架调节促进细胞骨架重构，从而实现AFCs以及BMSCs增殖及表达的上调。

基于上述研究结果，笔者认为：（1）BMSCs的非接触共培养对人退变AFCs的增殖及表达存在正向调节作用。（2）BMSCs的引入对人退变AFCs存在“力学保护作用”，主要体现为人退变AFCs对“恶性”应力刺激（15%及20%形变量）代偿能力的增加。（3）一定范围内的力学刺激可增加人退变AFCs的增殖及表达，且与BMSCs的共培养呈协同作用。

本研究体外模拟力学环境对共培养状态下的人退变AFCs实施一定时间的力学干预，证实了与BMSCs共培养对人退变AFCs的力学保护作用，对IVDD的细胞学治疗提供了一定的理论基础。本研究设计基于体外力学模型，在保证实验同质性的同时无法避免地排除了体内其他因素对AFCs的影响，有待于本课题组后续通过动物实验进行体内研究。

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（2016-10-02收稿 2017-05-03修回）

（本文编辑李国琪）

The response of cyclic tensile strain on the BMSCs co-cultured human degenerative anulus fibrosus cells

LI Shuang1,SUN Xiao-lei1,MA Xin-long1△,ZHANG Yang2,DENG Shu-cai1,HAO Yong-hong1
1 Department of Orthopedics,2 Institute of Orthopedics,Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China△

E-mail：xlspine@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of different cyclic tensile strains on the proliferation and expression of bone marrow stromal cells(BMSCs)-cocultured human degenerated anulus fibrosus(AF)cells.MethodsAF cells were isolated from a patient with degenerated intervertebral disc degeneration(IVD),which were co-cultured with BMSCs.The solely cultured AF cells were used as control group.The two groups of cells were expanded in monolayer,and cyclically strained for 3 hours,which were applied 0,5%,10%,15%and 20%strains at a frequency of 0.25 Hz using BioDynamic test instrument.A flow cytometry method was used to examine the AF cell proliferation at 24 hours followed the application of cyclic tensile strains.After the total RNA was extracted,real-time PCR technology was used to detect the gene expression of collagenⅠand aggrecan.ResultsUnder the same appropriate stress,the proliferative index(PI),the proportion of cells in the period of DNA synthesis,the expression of collagenⅠand aggrecan were significantly higher in the co-cultured group than those of control group(P＜0.05).However,the best mechanical stimulation was different in the two groups.For the AF cells,the peaks of PI,the proportion of cells in the period of S period,the expression of collagenⅠand aggrecan were found in the 10%strain group,while for the co-cultured cells,they were found in the 15%strain group.ConclusionCoculturing with BMSCs has a positive effect on the proliferation and expression of human degenerative fibrous ring cells,which can protect AF cells from bad stress stimulation.

intervertebral disk displacement;cells,cultured;cell proliferation;intervertebral disc degeneration;cyclic tensile strain;anulus fibrosus cells;co-culture；BMSCs椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，

R681.53

：A

10.11958/20161109

天津市卫生局科技基金（2012KZ052）

1天津市天津医院骨科（邮编300211），2骨科研究所

李爽（1984），男，住院医师，博士在读，主要从事脊柱外科及椎间盘修复等相关研究

△通讯作者 E-mail:xlspine@163.com