蛋白激酶C ζ抑制剂对皮肤鳞癌细胞A-431增殖和侵袭的影响

邢艳玲，吴静

蛋白激酶C ζ抑制剂对皮肤鳞癌细胞A-431增殖和侵袭的影响

邢艳玲1，吴静2∆

目的探讨蛋白激酶C（PKC）ζ抑制剂T5450996对皮肤鳞癌细胞A-431增殖和侵袭能力的影响。方法应用Z′-LYTE™试剂盒筛选PKCζ抑制剂T5450996；利用细胞增殖实验和细胞周期分析观察T5450996对皮肤鳞癌细胞A-431增殖的影响；运用划痕实验和侵袭实验分析T5450996对A-431迁移和侵袭能力的影响。结果T5450996 可以抑制 PKCζ激酶的活性，半数抑制浓度（IC50）约为 35 μmol/L；与对照组相比，35 μmol/L 和 70 μmol/L的T5450996可以显著抑制A-431细胞的增殖，阻滞A-431细胞周期；划痕实验和侵袭实验结果显示35 μmol/L和70 μmol/L的T5450996处理A-431细胞后，A-431细胞的迁移及侵袭能力明显下降（均P＜0.05），20 μmol/L的T5450996没有明显作用（均P＞0.05）。结论PKCζ抑制剂T5450996可显著抑制皮肤鳞癌细胞A-431的增殖和侵袭能力，是一个有潜在应用前景的小分子抑制剂。

蛋白激酶C；蛋白激酶抑制剂；皮肤肿瘤；细胞增殖；肿瘤侵润；肿瘤转移；A-431

皮肤癌主要包括鳞状细胞癌和基底细胞癌，近年来发病率逐渐升高［1］。作为细胞信号传导的重要组成部分，蛋白激酶C（PKC）在肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移过程中起着重要作用［2-3］。PKCζ为非典型 PKC 中的一个亚型，其与乳腺癌［4-5］、结肠癌［6］和胰腺癌［7］等多种恶性肿瘤的转移密切相关。因此，PKCζ可成为抗肿瘤药物治疗的靶点，而PKCζ抑制剂可阻断肿瘤细胞的信号传导。体外实验证实PKCζ假底物抑制剂可抑制多种PKC亚型的活性和转位［8］。本文研究PKCζ抑制剂T5450996对人皮肤鳞癌细胞株A-431增殖和侵袭能力的影响，探讨PKCζ抑制剂作为抗肿瘤增殖与转移药物的可行性和相关机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人皮肤鳞癌细胞株A-431购于中科院上海生物细胞所；PKCζ抑制剂T5450996（分子式C15H19N3O）购自乌克兰Enamine公司；DMEM培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司；Z′-LYTETM试剂盒购自美国Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自日本东仁化学科技公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国 Sigma公司；Transwell小室购自美国Millipore公司；6孔、96孔细胞培养板购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 PKCζ抑制剂筛选 根据Z′-LYTETM试剂盒使用说明书进行PKCζ抑制剂的筛选。首先，在384孔板中加入10 μL 体系溶液，包括 10 μmol/L 的三磷酸腺苷（ATP）、2 μmol/L的肽段底物、125 μg/L的PKCζ激酶和不同浓度的抑制剂，室温孵育1 h后再加入10 μL反应液孵育1 h，加入终止液终止反应，检测445 nm/520 nm波长的荧光信号比值并分析抑制率。

1.2.2 细胞培养与分组处理 皮肤鳞癌细胞株A-431接种于含有10%胎牛血清、4.5 g/L葡萄糖和双抗的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2条件下培养，细胞培养至对数生长期后分别用20、35和70 μmol/L的T5450996处理，对照组加入DMSO。

1.2.3 细胞增殖活性测定 采用CCK-8法。取对数生长期的A-431细胞，按4 000个/孔接种至96孔培养板中，分别加入浓度为 20、35、70 μmol/L 的 T5450996，每个浓度平行 4孔，并设一个对照组。将96孔板放入37℃、5%CO2孵育箱内培养72 h。每孔中加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h后在酶标仪上读取450 nm波长下的光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式细胞术分析细胞周期 于6孔细胞培养板每孔接种2×105个A-431细胞，孵育箱过夜培养后，分别用20、35和70 μmol/L的T5450996处理12 h，对照组加入DMSO，胰酶消化收集细胞，1 000 r/min离心15 min，重悬于200 μL 4℃预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，吹打均匀后，缓慢吸入到10 mL 95%的乙醇中，对细胞进行悬浮固定，4℃过夜。1 000 r/min离心弃乙醇，500 μL PBS重悬细胞，加入RNaseA至终浓度 100 mg/L，37 ℃水浴 30 min，碘化丙啶（PI，20 mg/L）避光染色30 min，上机检测，利用Mod Fit LT软件分析细胞周期。实验重复3次。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 于6孔细胞培养板每孔接种5×105个A-431细胞，过夜培养至细胞覆盖率为90%左右，在无血清DMEM培养液中饥饿培养12 h后，用10 μL枪头用力均匀地在培养板中划痕，无菌PBS洗涤3次，每孔加入新鲜无血清培养液2 mL，并分别加入20、35和70 μmol/L的T5450996，对照组加入DMSO，37℃、5%CO2下继续培养12 h。显微镜下观察并测量不同时间点（0、3、6、9、12 h）划痕的宽度，并根据宽度的变化来计算细胞迁移的距离。每孔计数4个随机距离，实验重复3次。

1.2.6 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 取50 μL稀释Matrigel铺于Transwell小室聚碳酸酯膜上，37℃孵育1 h使Matrigel聚合成凝胶，吸走小室中多余的液体，并在上室、下室分别加入200 μL和600 μL无血清培养液，37℃平衡过夜；取 20 μmol/L T5450996 处理组、35 μmol/L T5450996 处理组、70 μmol/L T5450996处理组和对照组对数生长期细胞，计数1×105个/孔，用200 μL无血清DMEM 培养液重悬，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱孵育24 h后，取出小室，用棉签擦去上室未穿过膜的细胞，4%中性甲醛固定10 min，吉姆萨染色10 min，PBS洗涤3次，干燥，倒置显微镜下随机选取5个视野计数穿过膜的细胞（×200），计算各组算术平均数，实验重复3次。

Fig.1 Molecular structure of T5450996图1 T5450996的分子结构式

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，2 组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PKCζ抑制剂的筛选 应用经典的PKCζ抑制剂筛选试剂盒，筛选得到小分子化合物T5450996（相对分子质量257.33）可以显著抑制PKCζ激酶的活性，并随着浓度的增大，抑制率增加，半数抑制浓度（IC50）约为 35 μmol/L，见图 1、2。

2.2 T5450996对皮肤鳞癌细胞A-431细胞增殖的影响 35 μmol/L、70 μmol/L 的 T5450996 处理组的OD值均低于20 μmol/L T5450996处理组和对照组细胞（F=8.973，P＜0.05），后2组差异无统计学意义（P＞0.05），35 μmol/L T5450996 处理组和 70 μmol/L T5450996处理组差异也无统计学意义（P＞0.05），见图3。

Fig.2 The inhibitory rate of PKCζ treated by T5450996图2 T5450996的PKCζ抑制率

Fig.3 Comparison of the OD values of cell proliferation between four groups图3 4组细胞增殖的OD值比较

2.3 T5450996对皮肤鳞癌细胞A-431细胞周期的影响 结果表明，35 μmol/L T5450996处理组、70 μmol/L T5450996处理组细胞的G0/G1期细胞比例显著高于20 μmol/L T5450996处理组和对照组，S期细胞比例显著低于20 μmol/L T5450996处理组和对照组，后2组差异无统计学意义（P＞0.05），G2/M期细胞比例差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.4 T5450996对皮肤鳞癌细胞A-431迁移能力的影响 T5450996处理细胞 12 h后，35 μmol/L T5450996处理组、70 μmol/L T5450996处理组细胞的迁移距离明显小于20 μmol/L T5450996处理组和对照组细胞（F=26.397，P＜0.05），后 2组差异无统计学意义（P＞0.05），见图 4。

Tab.1 Comparison of cell cycles between four groups表1 4组细胞的细胞周期比较 （n=6，%，±s）

Tab.1 Comparison of cell cycles between four groups表1 4组细胞的细胞周期比较 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与 20 μmol/L T5450996 处理组比较，P＜0.05

组别对照组20 μmol/L T5450996 处理组35 μmol/L T5450996 处理组70 μmol/L T5450996 处理组F G0/G1期74.49±3.87 75.32±4.06 82.26±2.84ab85.85±4.41ab18.612＊＊S期17.25±2.14 16.73±1.79 10.06±0.87ab7.34±1.45ab17.248＊＊G2/M期8.26±1.22 7.95±1.12 7.68±2.11 6.81±0.66 1.769

Fig.4 Comparison of the migration distances between four groups图4 4组细胞的迁移距离比较

2.5 T5450996对皮肤鳞癌细胞A-431侵袭能力的影响 20、35、70 μmol/L T5450996处理组和对照组的穿过小室的细胞数（单位：个）分别为74.22±13.31、32.34±5.93、28.67±7.63 及 82.81±15.58，差异有统计学意义（F=30.530，P＜0.01），其中 35、70 μmol/L T5450996 处理组低于 20 μmol/L T5450996处理组和对照组（P＜0.05），对照组和 20 μmol/L 处理组差异无统计学意义，35和70 μmol/L T5450996处理组差异也无统计学意义（P＞0.05），见图5。

Fig.5 Comparison of the invasion ability between four groups图5 4组细胞的侵袭能力比较（×200，比例尺=40 μm）

3 讨论

皮肤癌是常见的恶性肿瘤之一，其中鳞状细胞癌的侵袭转移能力较强，病死率更高［9］。目前，临床上治疗皮肤癌的方法有手术、放疗、化疗及冷冻等［10-12］，虽然可对患者的病情进行控制，但效果仍然存在一定局限性。

PKC是一组磷脂依赖性的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，对细胞的生长、增殖和分化起着重要的调节作用［13］。根据同工酶的结构、特性及激活剂的不同PKC 可分为以下 4 大类［14］：传统型 PKC，包括PKCα［15］、βⅠ、βⅡ、γ；新型 PKC，包括 PKCδ、ε、η、θ、μ；非典型 PKC，包括 PKCζ、ι（或 λ）；3 个 PRK 成员（PRK1～3）。研究表明，PKC也是肿瘤细胞转化的重要信号分子，参与调控肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭及转移多个过程［16］。同时，PKC可以被某些促癌剂如佛波酯所激活，也可以被某些抗癌剂所抑制［13］。近年来，已有大量的PKC抑制剂［17］被发现，如苔藓虫素［18］、Enzastaurin［19］、米哚妥林（PKC-412）［20］等已应用于肿瘤的临床治疗，取得了较理想的效果。研究发现，PKCζ过度表达与肿瘤的发生及侵袭转移密切 相关［4］。 近 年 来 文献 报道 ，PKCζ抑制 剂PKCZI195.17可抑制PKCζ活性，并可抑制乳腺癌细胞的趋化运动、迁移、侵袭和转移［21］。因此，PKCζ有可能成为诊断恶性肿瘤的分子标志物和抗肿瘤药物治疗的靶点。研究PKCζ抑制剂的作用和机制有助于新型抗肿瘤药物的开发和合理设计［8］。

本研究首先利用经典Z′-LYTE™试剂盒筛选到一个显著抑制PKCζ激酶活性的小分子化合物T5450996，其 IC50为 35 μmol/L。为了证实其在皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭中发挥作用，本研究利用细胞增殖实验、细胞周期分析、划痕实验和侵袭实验检测T5450996处理A-431后细胞增殖和侵袭能力的变化。细胞增殖实验结果显示，与对照组（DMSO处理组）比较，35 μmol/L 和 70 μmol/L T5450996可明显抑制A-431细胞的增殖；细胞周期分析显示，35 μmol/L和70 μmol/L T5450996可对皮肤鳞癌细胞A-431的细胞周期产生明显的阻滞作用，影响A-431细胞周期各时相的分布；划痕和侵袭实验结果表明，35 μmol/L 和 70 μmol/L T5450996 可以抑制皮肤鳞癌细胞A-431的迁移能力和侵袭能力。这些结果初步证实PKCζ抑制剂T5450996具有抑制皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭能力的作用，其具体的作用机制将进一步探讨。尽管T5450996抑制PKCζ作用的IC50值较高，但可以通过进一步的优化合成提高抑制效率。该PKCζ抑制剂T5450996的发现对于进一步研究PKCζ的结构功能、筛选出更加高效的抑制剂，并设计出新型抗癌制剂具有重要的临床意义。

综上所述，PKCζ抑制剂能够显著抑制皮肤鳞癌细胞的增殖和侵袭，有望作为抗肿瘤增殖与转移药物进一步开发利用，具有潜在的临床应用前景。

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（2017-04-12收稿 2017-05-16修回）
（本文编辑 李鹏）

The effect of PKC ζ inhibitor on the proliferation and invasion of skin squamous carcinoma cell line A-431

XING Yan-ling1,WU Jing2∆
1 Department of Dermatology,Xianshuigu Hospital Jinnan District,Tianjin 300350,China;2 Department of Clinical Laboratory,the Third Central Hospital of Tianjin,Tianjin Institute of Hepatobiliary Disease,Tianjin Key Laboratory of Artificial Cell,Artificial Cell Engineering Technology Research Center of Public Health MinistrycCorresponding Author E-mail:wujing_821013@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of protein kinase C(PKC)ζ inhibitor T5450996 on the proliferation and invasion of skin squamous carcinoma cell line A-431.MethodsPKCζ inhibitor T5450996 was screened through Z′-LYTE™kit.Cell proliferation assay and cell cycle analysis were used to observe the effects of T5450996 on the proliferation of skin squamous carcinoma A-431 cells.Scratch assay and invasion assay were used to explore the effects of T5450996 on the migration and invasion of skin squamous carcinoma A-431 cells.ResultsThe PKCζ inhibitor T5450996 can inhibit the activity of PKCζ kinase,and the IC50value of T5450996 was about 35 μmol/L.Compared to the control group,35 μmol/L and 70 μmol/L concentrations of T5450996 significantly suppressed the proliferation of A-431 cells and blocked the cell cycle of A-431 cells.The results of scratch assay and invasion assay indicated that the migration and invasion capacities of A-431 cells were markedly impaired after the treatments with 35 μmol/L and 70 μmol/L concentrations of T5450996(P＜0.05).However,20 μmol/L concentration of T5450996 showed no significant effect(P＞0.05).ConclusionPKCζ inhibitor T5450996 significantly inhibits the proliferation and invasion capacities of skin squamous carcinoma cell line A-431,and which may be a small molecular inhibitor with potential applications in the future.

protein kinase C;protein kinase inhibitors;skin neoplasms;cell proliferation;neoplasm invasiveness;neoplasm metastasis;A-431

R739.5

：A

10.11958/20170369

国家自然科学基金青年项目（81301985）；天津市应用基础与前沿技术研究计划青年项目（14JCQNJC14000）；天津市第三中心医院、卫生部人工细胞工程技术研究中心、天津市人工细胞重点实验室国家自然科学基金孵育项目（2017YNR3）

1天津市津南区咸水沽医院皮肤科（邮编300350）；2天津市第三中心医院检验科，天津市肝胆疾病研究所，天津市人工细胞重点实验室，卫生部人工细胞工程技术研究中心

邢艳玲（1982），女，硕士，主治医师，主要从事皮肤病、性病的研究

△通讯作者 E-mail:wujing_821013@sina.com