黄芪甲苷对大鼠骨骺干细胞增殖及生物学特性的影响

姜志洲董黎强尹 航

黄芪甲苷对大鼠骨骺干细胞增殖及生物学特性的影响

姜志洲1董黎强2尹 航1

目的探究黄芪甲苷对大鼠骨骺干细胞（PSCs）增殖及生物学特性的影响。方法将新生SD大鼠离体培养获取大鼠骨骺干细胞，选择黄芪甲苷对第3代骨骺干细胞进行干预诱导，体外培养，在倒置显微镜下观察细胞生长情况、记录细胞贴壁情况及时间、细胞形态变化及增殖情况。采用免疫组化Ⅱ型胶原单克隆抗体染色方法，检测诱导后细胞的生物学特性，MTT法检测细胞增殖活性。结果经黄芪甲苷干预诱导后，与对照组比较，实验组细胞增殖倍增时间加快（23.20h比30.17h，P<0.05）。第4天、第6天实验组PSCs细胞增殖活性较对照组显著提高，差异有统计学意义[第4天：（0.493±0.138）比（0.420±0.051），第6天：（0.612±0.151）比（0.517±0.153），P<0.05）]，实验组Ⅱ型胶原单克隆抗体染色表达阳性优于对照组。结论黄芪甲苷具有促进骨骺干细胞增殖的作用。经黄芪甲苷诱导培养的骨骺干细胞可以正常地分泌特征性基质，并保持骨骺干细胞的生物学特性。

大鼠；骨骺干细胞；黄芪甲苷；成纤维细胞生长因子-3

在儿童及青少年生长发育过程中，骨生长发育占据着十分重要的地位。骨骺中软骨细胞的增殖与分化决定了骨骺板的高度和骨的长度。由于软骨修复的能力有限，一旦造成骨骺损伤，就有可能影响骨及骨关节发育或出现畸形，从而影响儿童的骨骼发育[1]。骨骺干细胞（precartilaginous stem cells，PSCs）是存在于胚胎或新生动物四肢干骺端LaCroix环中及长骨干骺端静止区的一种成体干细胞，其在体外有持续增殖及定向分化的能力[2]。PSCs的分离和培养对未来临床治疗骨骺损伤和修复软骨的缺损和退化有重要意义。

但是分离出PSCs的来源非常有限，如何促进PSCs的增殖及分化，并使其保持良好的生物学特性，尤为重要。目前证实中药黄芪对软骨细胞增殖有促进作用及延缓软骨细胞退变的作用[3]。黄芪甲苷是从黄芪中提取的主要有效成分，研究[4-5]发现，黄芪甲苷具有促进骨髓干细胞及神经干细胞增殖作用。本实验研究黄芪甲苷对体外培养的PSCs的作用，探讨对其增殖及生物学特性的影响。

1 材料与仪器

1.1 主要试剂DMEM/F-12（Invitrogen公司，美国），胎牛血清（Gibco公司，美国），0.25%胰蛋白酶-0.53mmol EDTA（Invitrogen公司，美国），Rabbit Anti-FGFR-3（Santa-cruz公司，美国），Goat antirabbit IgGHRP（福州迈新生物技术有限公司），内源性过氧化酶阻断剂（福州迈新生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司），黄芪注射液（正大青春宝药业有限公司生产，10mL×6支，每支相当于原药材20g）。

1.2 主要仪器倒置相差荧光显微镜（BM-1000，南京江南永新光学有限公司），净化工作台（SW-CF-2FD，苏州净化设备有限公司），CO2细胞培养箱（3111，Thermo公司，美国），电热恒温培养箱（HZQF160，上海新苗医疗器械制造有限公司），ELX-800UV酶标检测仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.3 实验动物健康新生24h的清洁级SD大鼠，不限雌雄，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（沪）2008－0016。

2 方法

2.1 PSCs的取材、分离培养及鉴定借鉴尹航等[2]制备方法分离培养及鉴定出所需PSCs。

2.2 分组及干预将传代培养所得第3代并鉴定成功后的PSCs悬液，以每孔以1×104个细胞接种于2块24孔培养板上。随机分成对照组和实验组。在实验组中加入黄芪甲苷100μg/mL，3mL/d，对照组中加入无药培养液3mL/d。在之后的8天里，每间隔24h，分别从对照组和实验组中各取3孔，用0.25wt%胰蛋白酶进行充分消化，并在倒置显微镜下观察并计数。在倒置显微镜下观察培养细胞生长情况、记录细胞贴壁情况及时间、细胞形态变化及增殖情况。取均数绘制生长曲线图，按照如下公式[1og2/（1ogN1-logN0）] ×t[6]计算细胞群体倍增时间，其中N0代表接种时间、N1代表培养t小时后的细胞数。

2.3 MTT法检测PSCs增殖情况将诱导后的传代细胞接种于96孔培养板中，每孔l×104个细胞。分别在加入药液后第2天、4天、6天的时间点，用MTT法检测实验组和对照组PSCs的存活和增殖变化情况。在ELX-800UV酶标检测仪上以调零孔调零，在光波=490nm时测定各孔的吸光值（OD值）。记录实验数据。

2.4 PSCs的特性检测Ⅱ型胶原单克隆抗体染色，待诱导后的细胞在盖玻片上生长达到80%左右时，用4%多聚甲醛固定，在4℃培养过夜，用PBS溶液冲洗2～3次，每次约5min。在室温下Triton-100+ 0.5%BSA（胎牛蛋白）孵育30min后，用PBS溶液冲洗2～3次，每次约5min。兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体4℃培养过夜，用PBS溶液冲洗2～3次，每次约5min。FITC标记的二抗在室温条件下孵育30min后，用PBS溶液冲洗2～3次，每次约5min。在激光共聚焦显微镜下观察。

2.5 统计学方法应用SPSS19.0统计软件处理数据，计量资料以表示，采用t检验，P<0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芪甲苷对PSCs生物学作用的影响在接种之后的8天里，每间隔24h时间点用倒置显微镜分别观察实验组和对照组的细胞生长增殖情况（图1～ 6，封二），在6～7h后对照组PSCs基本完成细胞贴壁，细胞形态较饱满，呈上皮样细胞排列生长，散状分布生长，细胞重叠生长很少见。而实验组细胞增殖分化速度显著加快，细胞贴壁所需完成时间在4～6h左右，对照组细胞群体倍增时间为30.17h，实验组为23.20h，两组比较，P<0.05。细胞增殖分裂的高峰出现在第6天，之后开始形成平台期，分裂指数为35%，显微镜下观察两组的细胞形态变化基本类似。两组PSCs生长曲线见图7。

图7 黄芪甲苷对PSCs生长曲线的影响

3.2 MTT法检测黄芪甲苷对PSCs增殖活性的影响对照组和实验组的PSCs增殖活性，在第2天差异无统计学意义（P>0.05），在第4、6天时间点，实验组较对照组增殖活性显著提高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 黄芪甲苷对PSCs细胞增殖活性的影响

表1 黄芪甲苷对PSCs细胞增殖活性的影响

注：与对照组比较，△P<0.05；PSCs：骨骺干细胞

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3.3 PSCs的生物学特性检测实验组和对照组的PSCsⅡ型胶原单克隆抗体染色表达均呈阳性。实验组阳性表达强于对照组。见图8～9（封二）。

4 讨论

目前治疗修复骨骺损伤，仅仅单纯的保守复位外固定的治疗方法达不到解剖复位的要求，而内固定治疗也存在继发性骺生长板损伤或固定不可靠的相关问题，最终的治疗效果也不是很理想[6]。胚胎干细胞、间充质干细胞及脂肪源干细胞这三大类细胞是目前研究关节软骨损伤修复的主要的理想种子[7]，而现下的研究热点PSCs由于自身的优势，也入选并成为未来软骨自我再生修复的理想种子细胞。

体外培养PSCs所面临的问题是如何使PSCs更好地调控并使其保持正常的生物学特性。目前中医药在组织工程学方面的应用研究越来越广泛，在常用的中药中寻找到能够促进PSCs的体外培养，并保持正常的生物学特性的药物，为PSCs进一步的研究发展开拓了新道路。

《本草纲目》记载：黄芪“耆，长也。黄耆色黄，为补药之长，故名。”中药黄芪归肺、脾、肝、肾经，以补气之长，也有保护肾脏的功用[8]；而传统中医理论认为肾主骨，因此黄芪也是补肾强筋健骨的佳药[9]，具有修复软骨及骺板损伤的潜力。药理研究[10-11]发现，中药黄芪是取自豆科植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根部，含有多糖、皂苷、生物碱、氨基酸、多种矿物质及维生素等化学成分。其中黄芪甲苷是最主要的活性指标成分，其药理作用主要有[12-13]：（1）增强机体免疫力及抵抗疾病的能力。（2）抗病毒作用。（3）抗应激功效。（4）作为促生长剂。（5）改善心肺功能。

刘维统等[3]证实，适当浓度的黄芪甲苷具有促进软骨细胞的增殖作用，并保持软骨细胞的活性。王倩等[14]研究证实，中药黄芪对骨髓间充质干细胞增殖有明显促进作用，且维持其遗传物质染色体的稳定性。PSCs作为软骨细胞与骨髓间充质干细胞的中间过渡形式，黄芪是否也对体外培养的PSCs也有促进作用？本实验验证黄芪甲苷对PSCs增殖活性的影响作用，并测定其是否保持PSCs正常的生物学特性。

在本实验中将PSCs分泌的特征性基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖作为验证生物学特性的标志物。实验结果表明，显微镜下观察两组的细胞形态变化基本类似，但实验组细胞增殖分化速度显著加快，贴壁所需的时间较对照组缩短，说明黄芪甲苷能够明显加快PSCs的增殖速度。同时，用MTT法来检测PSCs的增殖活性，实验组PSCs的Ⅱ型胶原单克隆抗体染色均呈阳性[15]，表明黄芪甲苷对PSCs诱导后，能够促进PSCs的增殖并能保持正常的生物学特性。黄芪甲苷促进PSCs的增殖，其机制可能与黄芪的促生长作用与其它因子共同调控增殖分化相关基因的表达相关。研究[16]认为，干细胞具备先天之精的属性,是先天之精在细胞层次的存在形式，而黄芪的补气化血生髓作用，也为黄芪甲苷能够促进PSCs提供了相关理论依据。但是目前仍存在PSCs相关未解决的难题：（1）黄芪甲苷是通过何种具体途径及方式来影响调控PSCs的增殖生长？（2）黄芪甲苷诱导PSCs是否存在增殖分化过度的异常性？都需要进一步研究解决。

综上所述，黄芪甲苷具有促进PSCs增殖的作用。经黄芪甲苷诱导培养的PSCs可以正常地分泌特征性基质，并保持PSCs的生物学特性。该结果为今后进一步的PSCs体外诱导实验提供相关参考依据。

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黄芪甲苷对大鼠骨骺干细胞增殖及生物学特性的影响

图1 倒置显微镜下对照组骨骺干细胞培养24h后（伊100）

图2 倒置显微镜下实验组骨骺干细胞培养24h后（伊100）

图3 倒置显微镜下对照组骨骺干细胞培养4天后（伊100）

图5 倒置显微镜下对照组骨骺干细胞培养6天后（伊100）

图6 倒置显微镜下实验组骨骺干细胞培养6天后（伊100）

图8 倒置显微镜下对照组骨骺干细胞域型胶原单克隆抗体染色呈阳（域型胶原单克隆抗体染色伊100）

图9 倒置显微镜下实验组骨骺干细胞域型胶原单克隆抗体染色呈强阳性（域型胶原单克隆抗体染色伊100）

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（收稿：2016-08-09修回：2016-12-19）

Effect of Astragalosideon Proliferation and Biological Characteristics of Precartilaginous Stem Cells of Rats

JIANG Zhizhou1,DONG liqiang2,YIN hang1.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China; 2 Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China

ObjectiveTo investigate the effect of astragaloside on proliferation and biological characteristics of precartilaginous stem cellsin Rats.MethodsPrecartilaginous stem cellswere obtained fromnewborn SD rats and cultured in vitro,then the third generation precartilaginous stem cells were chosen to co-cultured with astragaloside.The growth of cells was observed by inverted microscope and the adhere time,circumstances,morphologic changes and proliferationof cells were recorded.Cell biological characteristics induced by astragaloside was tested with immunohisto chemistry Collagen typeⅡmonoclonal antibody staining,the activity of cells was detected by MMT assay.ResultsThe speed of cell proliferation accelerated in experiment group,with a population doubling time of 23.20 h compared to 30.17 h of control group（P<0.05）.On Day 4 and Day 6,the cells in experiment group showed higher activity than those in control group,with a significant difference（Day 4:0.493±0.138 vs 0.420±0.051;Day 6:0.612±0.151 vs 0.517±0.153;all P<0.05）.Collagen typeⅡmonoclonal antibody staining in experiment group and control group were both positive,but the staining was more obvious in experiment group.ConclusionAstragaloside can promote the growth of precartilaginous stem cells.Precartilaginous stem cells which was induced with astragaloside can normallysecrete characteristic matrix and keep the well biological characteristics of precartilaginous stem cells.

rats;precartilaginous stem cells;astragaloside;fibroblast growth factor receptor 3

浙江中医药大学校级科研基金重点项目（No.20102202）

1浙江中医药大学（杭州310053）；2浙江中医药大学附属第二医院骨科（杭州310005）

尹航，Tel：13675894037；E-mail：feidao95@126.com