消喘贴敷膏剂质量标准研究

王友凤，曹云飞，白小英

(1.山东中医药大学 山东 济南 250355； 2.莒县人民医院 山东日照 276500；3.青岛市海慈医疗集团 山东 青岛 266033 )



【中药与天然活性产物】

消喘贴敷膏剂质量标准研究

王友凤1，曹云飞2，白小英3*

(1.山东中医药大学 山东 济南 250355； 2.莒县人民医院 山东日照 276500；3.青岛市海慈医疗集团 山东 青岛 266033 )

为建立消喘贴敷膏剂的质量控制方法，本文采用薄层色谱法对消喘贴敷膏剂中的白芥子、延胡索、细辛、荜茇进行定性分析。采用高效液相色谱法对白芥子的芥子碱硫氰酸盐进行含量测定，色谱柱为Phenomenex Geminin C18色谱柱(150 mm×4.6 mm ，5 μm)，以乙腈-0.08 mol/L磷酸二氢钾溶液(13∶87，V/V)为流动相，检测波长326 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL。鉴定结果表明，4味中药斑点清晰，分离较好，阴性对照无干扰。芥子碱硫氰酸盐在0.84～8.4 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7)，平均加样回收率(n=6)为99.58 %(相对标准偏差为0.37 %)。该方法简单快捷、准确可靠，专属性强，可用于消喘贴敷膏剂的质量控制。

消喘贴敷膏剂；薄层色谱法；高效液相色谱法；芥子碱硫氰酸盐；质量标准

消喘贴敷膏剂是按照传统中医理论组方并结合现代工艺加工制成的凝胶贴膏剂，由白芥子、延胡索、细辛、荜茇4味中药的超微粉与适宜的基质制备而成，具有温肺化痰、散寒止痛、行气通络之功，主要用于支气管哮喘、慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、慢性咳嗽等。目前没有对该制剂质量标准进行研究的文献报导，为了对该制剂的安全性和有效性进行控制，参照《中国药典》2015年版一部及相关文献对其质量标准进行研究。本研究利用薄层色谱法对消喘贴敷膏剂中的白芥子、延胡索、细辛、荜茇进行定性鉴别，同时采用高效液相色谱法对处方中君药白芥子的主要药效成分芥子碱硫氰酸盐进行含量测定，该方法简便、准确、专属性强、重复性好，可作为控制消喘贴敷膏剂质量的方法。

1 仪器与试药

Agilent 1100 型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；KQ100 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；JA2003型电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；Buchi R215V 型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；HHW-4 型双显恒温水浴锅( 金坛市双捷实验仪器厂)；硅胶G预制薄层板( 德国MN公司，批号 707183)。

白芥子对照药材(批号121150-200502)、延胡索对照药材(批号120928-201208)、细辛对照药材(批号121204-201405)、荜茇对照药材(批号121023-201103)、芥子碱硫氰酸盐对照品(批号11702-201504)、延胡索乙素对照品( 批号 110726-201515)、细辛脂素对照品(批号111889-201504)、胡椒碱对照品( 批号111889-201504)(中国食品药品检定研究院),消喘贴敷膏剂(青岛海慈医疗集团制剂室),甲醇(色谱纯)、水(超纯水)、其他试剂(分析纯)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱法鉴别

2.1.1 白芥子的鉴别

参照文献[1-3]的方法，取本品2片，剪碎，加入30 mL甲醇，超声波处理1 h，滤过，滤液蒸干，加甲醇2 mL使残渣溶解，作供试品溶液。取白芥子对照药材1 g加甲醇30 mL，同样方法制得对照药材溶液。另取芥子碱硫氰酸盐对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。取处方中除去白芥子的其他药味，按照处方比例及工艺制成缺白芥子的阴性对照品，同供试品制备方法制成阴性对照品溶液。分别吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液与阴性对照品溶液各10 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(3.5∶5∶1∶0.5，V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液在相应位置上无干扰 ( 见图 1)。

2.1.2 延胡索的鉴别

参照文献[4-5]的方法，取本品2片，剪碎，加浓氨试液1 mL与三氯甲烷20 mL，浸渍1 h，超声波处理30 min，滤过，滤液蒸干，用甲醇1 mL使残渣溶解，滤过，滤液作供试品。取延胡索对照药材1 g加浓氨试液1 mL与三氯甲烷20 mL，同供试品制备方法制得对照药材溶液。另取延胡索乙素对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。取处方中除去延胡索的其他药味，按照处方比例及工艺制成缺延胡索的阴性对照品，同样方法法制成阴性对照品溶液。分别吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照品溶液各4 μL，对照品溶液1 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶2，V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约 5 min后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯( 365 nm) 下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液在相应位置上无干扰 (见图 2)。

1～3 供试品溶液;4 芥子对照药材溶液;5 芥子碱硫氰酸盐对照品溶液;6 阴性供试品溶液。图1 白芥子薄层色谱图Fig.1 TLC of Sinapis semenc

1～3 供试品溶液；4 延胡索对照药材溶液；5 延胡索乙素对照品溶液；6 阴性供试品溶液。图2 延胡索薄层色谱图Fig.2 TLC of orgdalis rhizoma

2.1.3 细辛的鉴别

参照文献[6]的方法，取细辛对照药材0.5 g加甲醇30 mL，同供试品制备方法制得对照药材溶液。另取细辛脂素对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。取处方中除去细辛的其他药味，按照处方比例及工艺制成缺细辛的阴性对照品，同供试品法制成阴性对照品溶液。分别吸取2.1.1项下白芥子供试品溶液以及上述对照药材溶液与对照品溶液、阴性对照品溶液各3 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1，V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%(g/mL)香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至显色清楚。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液在相应位置上无干扰 (见图 3)。

2.1.4 荜茇的鉴别

参照文献[7-8]的方法，取荜茇对照药材0.5 g加甲醇30 mL，同供试品制备方法制得对照药材溶液。另取胡椒碱对照品，加甲醇制成1 mL含4 mg的溶液，作为对照品溶液。取处方中除去荜茇的其他药味，按照处方比例及工艺制成缺荜茇的阴性对照品，同供试品法制成阴性对照品溶液。分别吸取2.1.1项下白芥子供试品溶液以及上述对照药材溶液与对照品溶液、阴性对照品溶液各2 μL ，点于同一硅胶 G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7∶2∶1，V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积分数10 %的硫酸乙醇，105 ℃加热至显色清楚。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液在相应位置上无干扰(见图 4)。

1～3 供试品溶液；4 细辛对照药材溶液；5 细辛脂素对照品溶液；6 阴性供试品溶液。图3 细辛薄层色谱图Fig.3 TLC of asari radix et rhizorma

1～3 供试品溶液；4 荜茇对照药材溶液；5 胡椒碱对照品溶液；6 阴性供试品溶液。图4 荜茇薄层色谱图Fig.4 TLC of piperis longi fructus

2.2 芥子碱硫氰酸盐含量测定

2.2.1 色谱条件

参照《中国药典》2015年版四部通则0512测定[9]， 色谱柱：Phenomenex Geminin C18色谱柱(150 mm×4.6 mm , 5 μm)；以乙腈-0.08 mol/L磷酸二氢钾溶液(13∶87，V/V)为流动相；检测波长326 nm；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量20 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备

取芥子碱硫氰酸盐对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为420 μg/mL芥子碱硫氰酸盐对照品贮备液，精密量取5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇制成浓度为210 μg/mL芥子碱硫氰酸盐对照品溶液[10]。

2.2.2.2 供试品溶液的制备

取消喘贴敷膏剂每批4贴，去背衬，剪碎，精密称定，加甲醇50 mL，超声处理(功率300 W,频率40 kHz)30 min，滤过，滤渣再用甲醇同法提取3次，滤液合并。减压回收溶剂，残渣用流动相溶解，转移至50 mL量瓶中，稀释至刻度，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得。

2.2.2.3 阴性对照品溶液的制备

取处方中除去白芥子的其他药味，按照处方比例及工艺制成缺白芥子的阴性对照品，再将该阴性对照品按供试品溶液的制备方法制备，过滤，即得。

2.2.3 专属性考察

取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析，测定结果见图5。结果表明，阴性对照品色谱中，与对照品和供试品色谱相应的位置上无干扰色谱峰出现，供试品色谱峰中，芥子碱硫氰酸盐峰与其他组分分离较好，说明该方法专属性良好[11]。

图5 芥子碱硫氰酸盐高效液相色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of sinapine thiocyanate

2.2.4 线性关系考察

图6 线性回归标准曲线图Fig.6 The standard curve of linear regression

精密量取芥子碱硫氰酸盐对照品贮备液用甲醇稀释至含芥子碱硫氰酸盐42.0、52.5、70.0、105.0、210.0、420.0 μg/mL系列对照品溶液，进样分析，以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图6。芥子碱硫氰酸盐线性回归方程为Y=1 512.3X-79.986，相关系数r=0.999 7。结果表明，芥子碱硫氰酸盐在0.84～8.4 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验

取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录相应峰面积，芥子碱硫氰酸盐峰面积的相对标准偏差为0.31 %，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取样品适量，按“2.2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，在相同的色谱条件下于0、5、10、15、20、24 h进行测定，结果芥子碱硫氰酸盐峰面积的相对标准偏差为0.79 %。结果表明,供试品溶液在24 h内有良好的稳定性。

2.2.7 重复性试验

取同批号样品6份，分别制备成供试品溶液，依法测定芥子碱硫氰酸盐含量，测得芥子碱硫氰酸盐含量平均值为2.32 毫克/贴，相对标准偏差为0.87 %，表明重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验

精密称定已知含量的消喘贴敷膏剂样品6份，分别精密加入一定量的芥子碱硫氰酸盐对照品，按“2.2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，平行进样，记录峰面积，计算芥子碱硫氰酸盐的平均回收率为99.61 %，相对标准偏差为0.38 %，结果见表1。

表1 消喘贴敷膏剂中芥子碱硫氰酸盐的加样回收试验(n=6)结果

2.2.9 样品测定

分别取3批消喘贴敷膏剂，按“2.2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定，3批样品中芥子碱硫氰酸盐的含量依次为2.33、2.32、2.32 毫克/贴。

3 讨论

在供试品制备方面，所制备的白芥子供试品同时可用于细辛、荜拨的薄层色谱鉴别，不仅节约成本且能提高日常检验工作效率；含量测定对提取方法进行考察，结果表明超声提取法和加热回流提取法的提取率没有明显的差异，从操作简便的角度出发选择超声提取法。对超声提取时间(10、30、50、70、90 min)进行考察，根据测定结果，30 min即可提取完全，所以选择超声提取时间为30 min。含量测定流动相考察，分别使用乙腈-3%冰醋酸(15∶85,V/V)、乙腈-0.08 mol/L磷酸二氢钾溶液(13∶87,V/V)、乙腈-0.1%磷酸溶液( 35∶65,V/V)作为流动相对本品进行测定，结果表明使用乙腈-0.08 mol/L磷酸二氢钾溶液(13∶87,V/V)为流动相时峰形、分离度均较好。

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015版一部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 160．

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[3]范晓雯, 马清河, 徐建军. 驱白白热斯酊中当归和白芥子的薄层鉴别[J]. 新疆中医药, 2012, 30(5): 58-59.

[4]郑弘, 许红玮. 延胡索不同炮制方法的薄层色谱鉴别对比研究[J]. 中医学报, 2013, 28 (5): 695-696.

[5]李瑞丽, 王喜民, 张玉东. 薄层色谱法鉴别胃康灵胶囊中白芍、三七和延胡索[J]. 亚太传统医药, 2013, 9(3): 19-20.

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[8]留杰, 张国梅. 三味白蔻汤中荜茇的薄层色谱鉴别[J]. 北方药学, 2012, 9(4): 7.

[9] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015版四部[M]. 北京: 中国医药科技出版社,2015.[10] 尹珉, 王宏, 曾祖平, 等. HPLC法测定喘宁巴布剂中芥子碱硫氰酸盐的含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(1): 21-22.

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Study on the quality standard of Xiaochuan Emplastrum

WANG you-feng1, CAO yun-fei2, BAI xiao-ying3*

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355，China; 2.Juxian People′s hospital, Rizhao 276500，China; 3.Qingdao Haici Medical Corp, Qingdao 266033，China)

∶To establish the quality control method of Xiaochuan Emplastrum,Sinapis Semen, Corydalis Rhizoma, Asari Radix et Rhizoma and Piperis Longi Fructus in the Xiaochuan Emplastrum were qualitatively analyzed by TLC. The content of sinapine thiocyanate in sinapis semen was determined by HPLC. The chromatographic column was Phenomenex Geminin C18column(150 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was acetonitrile-0.08 mol/L potassium phosphate monobasic (13∶87,V/V) at the flow rate of 1.0 mL/min, the detection wavelength of 326 nm, the column temperature of 25 ℃ and the sample volume of 20 μL. The results revealed that the spots in the TLC identification of Sinapis Semen, Corydalis Rhizoma, Asari Radix et Rhizoma and Piperis Longi Fructus were clear, well separated and without interference by the negative control. The calibration curve of sinapine thiocyanate showed good linearity in the range of 0.84～8.4 μg (r=0.999 7). The average recovery was 99.58 % (n=6,reltive standard deviatior is 0.37 %). This method is rapid, accurate, reliable, and specific, thus it can be used for the effective quality control of the Xiaochuan Emplastrum.

∶Xiaochuan Emplastrum; TLC; HPLC; sinapine thiocyanate; quality standard

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.008

2016-09-01

青岛市 2015—2016 年度中医药科研计划 (2015-zyy012)

王友凤(1991—)，女，硕士研究生，研究方向为中药制剂控制区研究、中药制剂剂型研究，E-mail：714307497@qq.com

*通信作者，白小英。E-mail：baixiaoying72@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)03-0039-06