经圆窗膜导入ADNF-9基因防治卡那霉素耳毒性的实验研究
2017-06-28郑国玺张璐瑶
景 阳,郑国玺,祝 康,张璐瑶,刘 晖,张 文
1.陕西省人民医院耳鼻咽喉科(西安710068),2.西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉科(西安710004)
经圆窗膜导入ADNF-9基因防治卡那霉素耳毒性的实验研究
景 阳1,郑国玺2△,祝 康2,张璐瑶2,刘 晖1,张 文1
1.陕西省人民医院耳鼻咽喉科(西安710068),2.西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉科(西安710004)
目的:探讨腺伴随病毒(AAV)介导活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)基因转染对卡那霉素致豚鼠耳毒性的拮抗作用。方法:选用80只白色红目豚鼠,听功能正常,随机分为四组,每组20只,A组(ADNF-9保护组):左耳经圆窗注入ADNF-9后肌注卡那霉素;B组(空载体组):左耳经圆窗注入AAV,后肌注卡那霉素;C组(人工淋巴液组):左耳经圆窗注入人工淋巴液后肌注卡那霉素;D组(空白对照组):仅肌注卡那霉素。卡那霉素均经大腿内侧注射400 mg/(kg·d),共给药6 d;停药后6、14 d各组均行听性脑干反应(ABR)检测,停药14 d后各组处死动物,行耳蜗石蜡病理切片及耳蜗基底膜铺片观察各组豚鼠耳蜗基底膜毛细胞形态学。结果:实验前所有豚鼠的听功能均正常;停药后6、14 d的ABR阈值A组为(32.54±5.28)dB和(33.52±2.26)dB;B组为(77.56±4.18)dB和(78.00±5.48)dB;C组为(75.24±6.72)dB和(77.25±4.65)dB;D组为(78.00±3.32)dB和(78.25±3.26)dB。A组停药后6、14 d与B组、C组及D组比较有统计学差异(P<0.05 )。耳蜗病理切片及基底膜铺片均提示:A组耳蜗螺旋器细胞损害较轻,基底膜板基本完整;其余三组,耳蜗螺旋器毛细胞损害严重,基底膜有不同程度的损害。结论:ADNF-9基因转染可以有效拮抗氨基糖苷类所致豚鼠耳毒性。
氨基糖苷类抗生素广泛应用于临床,但也因严重的不可逆的耳毒性限制了其应用。倪月秋等[1]发现,庆大霉素致聋豚鼠的部分耳蜗毛细胞具有一定的再生能力。沈啸洪等[2]发现用中药补肾聪耳片治疗卡那霉素致聋豚鼠后,极少数耳蜗基底膜有所恢复,听毛排列整齐,甚至可见绒纤毛,证实了听毛细胞有恢复的迹象。本研究试图从电生理学及行态学方面证实活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)基因转染可以有效拮抗氨基糖苷类所致豚鼠耳毒性。
材料与方法
1 材 料 耳廓反射正常的白色红目豚鼠80只,体重250~350 g,雌雄不限,经测ABR反应阈值正常(西安交通大学实验动物中心提供);卡那霉素(天津药业焦作有限公司提供);ADNF-9、AAV和人工淋巴液(由西安华广生物工程有限公司提供)。
2 实验动物分组及处理 80只豚鼠随机分为四组,每组20只。A组(ADNF-9保护组):左耳经圆窗导入ADNF-9后肌注卡那霉素,共注射6 d;B组(空载体组):左耳经圆窗注入载体腺伴随病毒(AAV)后肌注卡那霉素,共注射6 d;C组(人工淋巴液组):左耳经圆窗注入人工淋巴液后肌注卡那霉素,共注射6 d;D组(空白对照组):仅肌注卡那霉素。卡那霉素均按400 mg/(kg·d)大腿内侧注射,停药6、14 d进行听力学检测,每天根据动物实际重量调整卡那霉素用量。
3 经圆窗给药方式 按30 mg/kg的戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司)腹腔注射麻醉A、B、C组豚鼠,麻醉满意后,常规消毒铺巾,选取左侧耳背进路,充分暴露听泡,在解剖显微镜下打开听泡及暴露圆窗。A组用微量注射器将10 μl携带ADNF-9(包含1011个病毒颗粒)的溶液缓慢注入圆窗,缝合耳后切口,B组、C组以同样的方法注入空载体及人工淋巴液10 μl,D组不做任何处理。
4 ABR测定 在用药前、停药后6 d及停药后14 d进行ABR检测。测试仪器为美国TDT公司的电生理测试仪。豚鼠按30 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔麻醉后,电极插入颅顶皮下作为记录点击,同侧乳突皮下置入参考电极,对侧乳突皮下置入接地电极,刺激率为21.1次/ms,带通滤波100~3000 Hz,扫描时间12 ms,叠加512次,以波Ⅲ的最小刺激强度为反应阈值。
5 耳蜗病理切片制备与观察 将每组取8只豚鼠断头,从枕骨大孔进剪,沿颅骨矢状缝向前(鼻尖部)剪开颅骨,在小脑部位向左右外压力,使颞骨和周围组织分离,取出颞骨,打开听泡迅速放入10%的中性福尔马林中,解剖显微镜下挑开圆窗膜,挑除镫骨,敞开前庭窗。在蜗尖部垂直于蜗轴进针,掀掉一小片骨壳。用玻璃吸管吸取固定液从蜗尖部将固定液挤压注入耳蜗内,灌注5管即可。这样,前庭阶及鼓阶就充满了固定液,然后再固定24 h。将固定的颞骨周围组织尽量修剪掉充分暴露耳蜗组织,将颞骨修成一块与蜗轴方向一致的长方形,用10%的甲酸脱钙48 h,流水冲洗4 h。脱水、浸腊,将标本蜗轴摆水平位进行包埋。沿蜗轴平行切面,连续切片,每片17 μm。采用HE游离切片染色的方法。切片经石炭酸,二甲苯透明后,摊平在载玻片上,加1滴加拿大树胶封固,标号后放室温下晾干,光学显微镜下镜检。
6 耳蜗毛细胞铺片制备与观察 取每组剩余豚鼠断头,解剖并完整取出听泡,暴露耳蜗,挑开蜗尖、前庭窗,先后分别用5%的硝酸银溶液、10%中性福尔马林溶液从蜗尖至蜗底反复灌洗数次,日光暴晒,福尔马林溶液固定,在解剖显微镜下行耳蜗基底膜铺片,观察耳蜗基底膜毛细胞的变化。
结 果
1 各组动物生长情况 实验过程中,各组实验动物都有不同程度的死亡,空白对照组死亡2只,ADNF-9保护组死亡3只,空载体组死亡3只,人工淋巴液组死亡1只。各组实验动物体重都有不同程度的减轻,但差异无统计学意义(P>0.05)。
2 ABR阈值测定 各组动物给药前后ABR具体反应阈值见表1。四组给药前ABR阈值无统计学差异(P>0.05)。停药后6、14 d ,B组、C组及D组ABR阈值比较无统计学差异(P>0.05);停药后6、14 d,A组的ABR阈值与B组、C组及D组比较有统计学差异(P<0.05 )。
表1 不同组各时间点的ABR阈值比较(dB)
注:与B组、C组、D组比较,*P<0.05
3 取材时中耳腔情况 取出听泡后在显微镜下发现鼓室黏膜无增厚及充血,鼓室内无肉芽组织增生,无渗出液,圆窗膜无增厚等现象。
4 耳蜗HE染色情况 A组耳蜗螺旋器毛细胞损害较轻,基底膜板基本完整(图1)。其余三组耳蜗螺旋器毛细胞损害严重,以外毛细胞为甚,内毛细胞损害较轻,基底膜板亦有不同程度损坏(图2)。
5 耳蜗毛细胞铺片情况 A组可见耳蜗基底膜基本完整,内毛细胞和外毛细胞整齐排列,可见点状缺失(图3A)。其余三组耳蜗基底膜可见不同程度的破坏,外毛细胞较内毛细胞损害重,可见片状缺失(图3B,图3C,图3D)。
图1 A组石蜡病理切片(HE染色×100)
图2 B组石蜡病理切片(HE染色×100)
图3 耳蜗毛细胞铺片(硝酸银染色×100)
讨 论
氨基糖苷类抗生素具有抗菌谱广、性质稳定、杀菌力强及价格便宜等特点,一直作为抗革兰阳性菌和革兰阴性菌的有效药物应用于临床。氨基糖苷类药物中毒性聋成为耳聋的重要原因之一,尤其对儿童危害更大,更易造成儿童的永久性听力丧失[3]。对氨基糖苷类抗生素耳毒性发病机制大多数学者认为主要是由于外毛细胞K+/Ca2+通道受氨基糖苷类抗生素的影响,引起神经系统的阻滞,进而使耳蜗毛细胞和听神经得功能受到影响[4]。Schacht等[5]研究发现氨基糖苷类抗生素的急性中毒反应可能是阻断了外毛细胞膜Ca2+通道和钙电流抑制耳蜗微音器电位。氨基糖苷类抗生素慢性中毒所涉及的机制比较复杂,观点主要集中在线粒体基因突变,自由基氧化损伤,经兴奋性毒性和听觉传出神经系统等[6]。
神经营养因子是由靶组织分泌的一类特殊的蛋白质分子,在神经干细胞增殖、分化及存活的过程中必不可少,一方面可以为神经元提供营养,促进神经细胞的生长和发育,另一方面保护神经元,促进修复周围神经[7]。而神经营养因子中有一类活性依赖性神经营养因子(ADNF)。研究者发现了ADNF-14上有一段9肽ADNF,比ADNF-14具有更强的营养和保护神经的功能,而且发挥作用的浓度更加多样化[8]。有研究者发现用ADNF-9保护用河豚毒素(TTX)作用后的大脑皮层细胞,发现ADNF-9增减一个氨基酸引起ADNF-9作用水平的下降。Gordon等[9]研究发现用很低的一个浓度ADNF-9取拮抗在FeSO4作用的海马细胞,发现海马细胞死亡数减少,而且细胞内的线粒体功能得到提高,同时活性氧的聚集减少,从而减轻了海马细胞损伤。有研究发现ADNF-9为神经元提供营养,促进神经元突触早期的形成[10]。ADNF-9分子量较小,可以通过血脑屏障,从而发挥功能。本课题前期研究发现ADNF-9可以通过血迷路屏障,成功转染新生大鼠耳蜗,使其在内耳表达和发挥作用[11-12]。
基因治疗是通过某种手段外源基因导入生物体的靶细胞内,使其在靶细胞内进行表达,来达到弥补生物体所缺失的功能或抑制某些基因的表达。有研究发现Atoh1基因可以成功转染到哺乳动物耳蜗,促进Corti器功能恢复。也有研究者发现氨基糖苷类中毒所致豚鼠耳蜗也可以被Atoh1基因所转染,而且使耳蜗毛细胞再生[13]。所以内耳的基因治疗是可行的。如何选择一种方便、合适的载体成为了重中之重。应用于内耳基因治疗的载体大致可分为两大类:非病毒载体和病毒载体。各种不同的载体有其不同的特点。有研究发现NGB基因可以在耳蜗表达,有效拮抗氨基糖苷类抗生素的耳毒性[14]。本研究所使用的AAV 载体较其他载体有其独特的特点,如转染率较高,转染的细胞范围较广,不携带病原性等[15]。本研究将腺伴随病毒介导ADNF-9基因导入氨基糖苷类药物中毒的豚鼠耳蜗内,结果表明,ADNF-9保护组的实验动物的听功能和耳蜗毛细胞受损程度较人工淋巴液组、空载体组及空白对照组明显小。从而证实了ADNF-9对耳蜗组织的形态和功能的恢复起到了一定的作用。但对于ADNF-9基因转染拮抗氨基糖苷类耳毒性的具体机制还有待于进一步的研究。
[1] 倪月秋.中药对氨基糖苷类抗生素致聋耳蜗毛细胞再生修复影响的研究进展[J].沈阳医学院学报,2010,12(4):193-196.
[2] 沈啸洪,林文森.补肾聪耳片对卡那霉素致聋豚鼠听毛细胞修复研究[J].天津医药,2004,32(1):38-39.
[3] 伍 越,郑 静,郑斌娇,等.氨基糖苷类抗生素耳毒性的保护和修饰[J].中华儿科学杂志,2012,10(2):260-269.
[4] Takumida M,Takumida H,Anniko M.Localization of sirtuins in the mouse inner ear[J].Acta Otolaryngol,2014,134(4):331-338.
[5] Schacht J.Altschuler R,Burke DT,etal.Alleles that modulate late life hearing in genetically heterogeneous mice[J].Neurobiol Aging,2012,33(8):1842.
[6] Campbell KC,Martin SM,Meech RP,etal.D-methionine(D-met)significantly reduces kanamycin-induced ototoxicity in pigmented guiea pigs[J].IntJ Audiol,2016,55(5):273-278.
[7] Shakhbazau A,Martinez JA,Xu QG,etal.Evidence for a systemic regulation of neurotrophin synthesis in response to peripheral nerve injury[J].J Neurochem,2012,122:501-511.
[8] Sari Y.Experimental methods for testing the effect of neurotrophic Peptide ADNF-9 against alcohol-induced apoptosis during pregnancy inC57bl/6 mice[J].J Vis Exp,2013,24(74):5009-5012.
[9] Gordon T.The physiology of neural injury and regeneration:the role of neurotrophic factors[J].J Commun Disord,2010,43:265-273.
[10] Katsari E,Zikos C,Tziveleka LA,etal.Cholesteryl-functionalized ADNF-9 peptide:enhanced membrane transport through mouse neuroblastoma Neuro-2a cells[J].Chem Biol Drug Des,2012,80(1):148-154.
[11] 郑国玺,祝 康,韦俊荣,等.重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9转染大鼠耳蜗组织的体外研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2009,23(4):170-173.
[12] 景 阳,郑国玺,祝 康,等.腺伴随病毒介导ADNF-9基因转染对豚鼠卡那霉素致聋的治疗作用[J].江苏大学学报:医学版,2015,25(5):369-372.
[13] Stojanova ZP,Kwan T,Segil N.Epigenetic regulation of Atoh1 guides hair cell development in the mammalian cochlea[J].Development,2015,142(20):3529-3536.
[14] 任 毅,周 琦,唐安洲,等.NGB基因转染拮抗庆大霉素耳毒性作用的实验研究[J].听力学及言语疾病杂志,2012,20(4):349-353.
[15] Fuchs SP,Martinez-Navio JM,Gao G,etal.Recombinant AAV Vectors for Enhanced of Authentic IgG[J].PLos One,2016,11(4):158-159.
(收稿:2016-07-14)
*高等学校博士学科专项科研基金项目(20120201110060)
卡那霉素 毛细胞,耳 圆窗,耳 基因 转染 @活性依赖性神经营养因子-9
R764.4
A
10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.002
△通讯作者