电针对完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠脊髓组织中Caspase-9、细胞色素C及凋亡蛋白酶激活因子-1表达的影响①

许明，张泓，刘继生，尹秀婷，张健，黄桂兰，艾坤

电针对完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠脊髓组织中Caspase-9、细胞色素C及凋亡蛋白酶激活因子-1表达的影响①

许明，张泓，刘继生，尹秀婷，张健，黄桂兰，艾坤

目的观察电针对完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱功能及脊髓组织中Caspase-9、细胞色素C(Cyt-C)及凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)表达的影响。方法雌性Sprague-Dawley大鼠60只，随机抽取36只，采用改良T10脊髓横断法制作完全性脊髓损伤后神经源性膀胱模型，取24只成功模型分为模型组和电针组各12只，其余未造模大鼠24只随机分为假手术组和空白组各12只。于造模后第19天取次髎、中极、三阴交、大椎行电针，连续7 d后行尿流动力学检测，TUNEL法测定细胞凋亡率，Western blotting测定脊髓组织中Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白的表达情况。结果与空白组和假手术组比较，模型组和电针组膀胱最大容量及膀胱顺应性均明显降低(P＜0.01)，膀胱基础压力和漏尿点压力增加(P＜0.05)；脊髓组织TUNEL阳性率显著升高(P＜0.001)；脊髓组织中Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白表达升高(P＜0.05)。与模型组比较，电针组的膀胱最大容量及膀胱顺应性明显增加(P＜0.01)，膀胱基础压力和漏尿点压力降低(P＜0.05)；脊髓组织TUNEL阳性率明显降低(P＜0.01)；脊髓组织中Caspase-9、Cyt-C及Apaf-1蛋白表达量降低(P＜0.05)。结论电针次髎、中极、三阴交、大椎可改善完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱功能，其作用机制可能与脊髓组织中Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1的表达下调，凋亡减少有关。

脊髓损伤；神经源性膀胱；电针；Caspase-9；细胞色素C；凋亡蛋白酶激活因子-1；凋亡；大鼠

[本文著录格式]许明，张泓，刘继生，等.电针对完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠脊髓组织中Caspase-9、细胞色素C及凋亡蛋白酶激活因子-1表达的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(6):628-633.

CITED AS:Xu M,Zhang H,Liu JS,et al.Effect of electroacupuncture on expression of caspase-9,cytochrome c and apoptotic protease activating factor 1 in spinal tissue in rats with neurogenic bladder after complete spinal cord injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(6):628-633.

神经源性膀胱是一类由于神经系统病变导致膀胱和尿道功能障碍，进而产生一系列下尿路症状的疾病总称，是脊髓损伤后严重的并发症[1]。治疗脊髓损伤后神经源性膀胱的方法很多，其作用机制涉及调节膀胱平滑肌功能、改善下尿路神经支配等多个方面[2]。近年来大量实验研究表明[3-4]，线粒体通路在细胞凋亡机制中起着至关重要的作用，由Caspase-9、细胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)和凋亡蛋白酶激活因子-1 (apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1)组成的凋亡小体进一步激活凋亡效应蛋白Caspase-3，引发神经细胞凋亡。

电针治疗神经源性膀胱的疗效显著。本研究通过观察电针次髎、中极、三阴交、大椎对骶上完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱压力、最大容量、顺应性改变及脊髓组织Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白表达水平的影响，进一步探讨电针治疗骶上完全性脊髓损伤后神经源性膀胱的可能机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与仪器

健康雌性SPF级Sprague-Dawley大鼠60只，许可证号SCXK(湘)2013-0004，体质量(220±20)g，饲喂于湖南中医药大学动物实验中心实验室，使用许可证号SYXK(湘)2013-0005。适应1周后进行实验。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[5]。

21710-1-AP型Rabbit抗体：美国PROTEINTECH。超敏发光液：美国THERMO PIERCE。显影液、定影液：长沙维世尔生物科技有限公司。TUNEL试剂盒，标号KGA7045：南京凯基生物科技发展有限公司。MP150-WSW多通道生理记录仪：美国BIOPAC公司。164-5050电泳仪：美国BIO-RAD。DYCZ-40A转膜仪：中国北京六一仪器厂。SDZ-V型华佗牌电针治疗仪：苏州医疗用品厂有限公司。

1.2 模型建立及分组

将60只大鼠按照随机数字表法选取36只，制作骶上完全性脊髓损伤后神经源性膀胱模型[6]：暴露T10节段脊髓，快速切断后依次缝合肌肉、筋膜和皮肤；术后用大笼单笼饲养，定时翻身与清洁护理，Crede手法辅助排尿，防酸碱失衡和电解质紊乱，抗感染等对症治疗；观察造模大鼠双后肢运动功能状态及膀胱情况，双后肢自主运动或自主排尿、自噬或死亡的大鼠，不纳入实验。

经后肢运动功能及膀胱排尿情况评价[6]确定成功的神经源性膀胱模型大鼠随机抽取24只分为模型组(n=12)和电针组(n=12)。其余24只随机分为假手术组(n=12)和空白组(n=12)。假手术组仅暴露脊髓10 min后依次缝合，予抗感染处理；空白组不做特殊处理。

1.3 腧穴与电针方法

电针组参照“十五”国家规划统编教材《实验针灸学》大鼠标准穴位图谱[7]进行腧穴定位。次髎[8]：第2、3骶骨的棘突间隙正中偏上处旁开5～10 mm，直刺15 mm。中极：腹正中线上，胸锁联合与耻骨联合上缘连线的上3/4与下1/4的交点定位为神阙穴，神阙穴与耻骨联合上缘连线的上4/5与下1/5的交点为中极穴，斜刺5 mm。三阴交：后肢内踝尖直上方1 cm处，直刺5 mm。大椎：背部正中第7颈椎和第1胸椎间，直刺10 mm。将经过手法排尿后的大鼠温和固定于鼠架上，用30号1寸针直刺，进针后接SDZ-V型华佗牌电针治疗仪，设定为疏密波(密波50 Hz，疏波10 Hz)，两组分别接中极与三阴交、次髎与大椎。刺激强度以肢体轻颤不发生为度。电针时间20 min，于造模后第19天[6]开始电针干预，连续7 d，每天1次。其余三组束缚20 min，不进行电针干预。

1.4 标本采集与处理

各组动物完成尿流动力学检测后，以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉，取脊髓T10节段上下各0.5～1 cm脊髓组织，经4℃生理盐水漂净，滤纸吸干，一部分脊髓组织-80℃冰箱冻存待用，另一部分经10%中性甲醛固定后做石蜡切片。

1.5 检测指标

1.5.1 尿流动力学测定

电针干预7 d后行尿流动力学检测，各组平行交替进行，记录膀胱压力曲线图。以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，排空大鼠膀胱，经尿道轻导入F3导管，以三通管连接MP150-WSW多通道生理记录仪与微量灌注泵，以0.1 ml/min速率[9]匀速注入温度为25～35℃的生理盐水，同步记录膀胱压力(1 cmH2O=0.098 kPa)。导尿管进入膀胱的起始压力为膀胱基础压，膀胱最大容量为尿道口首次流出液体时的灌注容积，此时压力为漏尿点压力，膀胱顺应性为膀胱容量的变化与压力变化的比值。

1.5.2 TUNEL法检测

各组大鼠脊髓组织石蜡包埋后切片，二甲苯脱蜡2次，100%、95%、80%、75%乙醇水合，每次5 min，浸入3%H2O2封闭液中，室温(15～25℃)封闭10 min，加热修复抗原，冷却后依次加入TdT酶反应液、Streptavidin-FITC标记工作液，放入温盒中，37℃避光反应60 min，荧光显微镜检测。POD标记后采用DAB显色，显色后的样本片浸入PBS，漂洗3次，每次5 min，用苏木素复染后晾干，加中性树胶和盖玻片，光镜下观察拍照。普通电脑采集照片后，用图像分析软件Image-Pro Plus对400倍视野进行分析，取平均数，细胞凋亡阳性率为视野下计数的阳性细胞占细胞核总数的比值。

1.5.3 Western blotting

按RIPA裂解液说明书提取细胞总蛋白，参照BCA蛋白定量试剂盒(WELLBIOLOGY)使用说明操作测定蛋白浓度。取样与5×loading buffer混匀，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷。根据蛋白定量的结果，每空上样已变性蛋白5 μl，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止。分别切胶Caspase-9(36 kD,46 kD)、Cyt-C(14 kD)、Apaf-1(130～142 kD)，β-actin(42 kD)，转至PVDF膜，盖上仪器，接通电源，转膜300 mA，Caspase-9约70 min、Cyt-C约30 min、Apaf-1约160 min、β-actin约1 h，用5%脱脂奶粉将膜浸入后，室温放置1 h。将膜与Caspase-9(1∶1000)、Cyt-C(1∶500)、Apaf-1(1∶2000)、β-actin(1∶4000)一抗一起孵育，4℃过夜。用1×TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例1∶3000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45～60 min，1×TBST洗3次，每次15 min。ECL显色曝光后底片扫描，Quantity One专业灰度分析软件分析目的蛋白和内参β-actin蛋白的灰度值，以两者灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行处理。计量资料用(xˉ±s)表示，进行正态性检验，符合正态分布者，用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐者用LSD法，方差不齐者用Dunnett's T3法；不符合正态分布者，采用秩和检验(K Independent Samples)。显著性水平α= 0.05。

2 结果

2.1 一般情况

造模过程中5只大鼠死亡，1只自噬，1只后肢运动功能基本正常，均予剔除。造模后18 d存活有29只大鼠符合模型要求。模型大鼠排尿次数增多，单次尿量减少，饮食减少，体质量下降，空白组与假手术组无死亡，活动及饮食、排尿、排便等较之前无明显差别。

2.2 尿流动力学检测

与空白组和假手术组比较，模型组和电针组膀胱最大容量及膀胱顺应性均明显降低(P＜0.01)，膀胱基础压力和漏尿点压力增加(P＜0.05)。与模型组比较，电针组的膀胱最大容量及膀胱顺应性明显增加(P＜0.01)，膀胱基础压力和漏尿点压力降低(P＜0.05)。空白组与假手术组各项无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

2.3 脊髓凋亡情况

TUNEL染色中，核染成棕(黄)色或褐色的细胞为阳性细胞，空白组和假手术组脊髓组织中可见少量散在阳性细胞，模型组和电针组脊髓组织中阳性细胞较多。见图1。

空白组与假手术组的脊髓组织TUNEL阳性率无显著性差异(P＞0.05)。与空白组和假手术组比较，模型组和电针组脊髓组织TUNEL阳性率显著升高(P＜0.001)；与模型组比较，电针组脊髓组织TUNEL阳性率明显降低(P＜0.01)。见表2。

表1 尿流动力学检测结果

表2 各组大鼠脊髓组织TUNEL阳性率的比较(%)

2.4 Western blotting

与空白组和假手术组比较，模型组和电针组的Caspase-9、Cyt-C及Apaf-1蛋白表达量增加(P＜0.05)。与模型组比较，电针组Caspase-9、Cyt-C及 Apaf-1蛋白表达量降低(P＜0.05)；空白组与假手术组的Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白表达量无显著性差异(P＞0.05)。见表3、图2。

表3 各组Western blotting检测结果

图2 各组Western blotting检测结果

3 讨论

祖国医学认为脊髓损伤属于“痿证”，神经源性膀胱相当于“遗溺”“小便不禁”范畴，本研究选择次髎、中极、三阴交、大椎穴进行电针干预。从现代解剖及排尿反射神经通路来分析，排尿中枢位于骶丛神经，而次髎位于第2骶后孔处，内有骶神经支配膀胱等盆腔脏器，神经冲动传入S1～S3节段，电针可直接刺激骶神经根传出神经，调节逼尿肌及膀胱内括约肌运动[10]；中极通过自主神经刺激传入神经，调节膀胱活动，促进其功能恢复[11]；三阴交下有来自于L4～S3神经根的胫神经通过，该穴浅层有属L4神经节段的隐神经，深层属L5、S1神经节段支配[12]，电刺激该穴可通过反射弧传到脊髓后根，调节腰骶部排尿中枢，双向调节膀胱的顺应性；大椎穴位于脊髓上端。电针在损伤的脊髓处产生一个比较恒定的脉冲电场，保护脊髓神经元的功能，从而改善膀胱神经支配。

目前临床对大多数神经源性膀胱患者的主要治疗手段仍是保守治疗，主要包括膀胱功能训练，电、磁刺激疗法以及针灸疗法。其中，针灸具有疗效确切、操作简便、成本低廉、无创性、毒副作用小的独特优势，而电针既具有针刺的治疗作用，也具有电刺激效应。近年来大量的临床[13-15]和实验研究[16-17]也证实电针对脊髓损伤后神经源性膀胱的疗效确切，但是评价疗效的标准尚不完全一致。

尿流动力学检测是目前对神经源性膀胱进行诊断及疗效评价的“金标准”，能够比较准确地反映膀胱的储尿及排尿功能，为神经源性膀胱的疗效提供评价参数[18-19]。近年来出现不少用尿流动力学检测膀胱功能的研究，但电针治疗脊髓损伤后神经源性膀胱的尿流动力学疗效评价很少。本实验观察到模型大鼠的膀胱最大容量及膀胱顺应性比空白组和假手术组明显下降，膀胱压力明显增加，出现尿频、尿急、漏尿等尿失禁表现；而电针后大鼠的膀胱最大容量、膀胱压力及膀胱顺应性比模型组有改善。说明电针可增加骶上脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠的膀胱最大容量及顺应性，缓解逼尿肌痉挛，从而降低膀胱压力，部分解决骶上脊髓损伤患者的下尿路障碍问题。

本实验中采用10%水合氯醛麻醉大鼠后进行尿流动力学检测，通过测定膀胱内压评估大鼠膀胱功能障碍，与通过尿道括约肌肌电信号测量评估方法一样，其数据的准确性被大多数研究者认为可能会受到麻醉状态的部分影响[20]。但本实验中各组大鼠的测压均在麻醉状态下测量，因而不影响对电针疗效的评估及作用机制的探讨，然而如何在实验大鼠保持清醒的状态下测量尿流动力学参数仍是目前研究的一个难点。

目前的研究表明，至少有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径三条通路参与凋亡的发生[21]，细胞凋亡依次经历凋亡诱导、调控执行和效应三个阶段。Caspase-9诱导的凋亡主要是线粒体依赖途径。线粒体外膜释放的Cyt-C，在ATP/dATP的参与下与Apaf-1结合，使Apaf-1发生构象改变，继而寡聚化，并通过Apaf-1氨基端和procaspase-9的功能前区之间的相互作用，促使Caspase-9前体与Apaf-1氨基端结合，形成分子量为700～1400 kD的细胞“凋亡小体”，在胞质中dATP的作用下进一步激活Caspase-9。活化后的Caspase-9能激活作为细胞凋亡执行者的Caspase-3，通过特异性地裂解一套底物而导致细胞凋亡[22-24]。本研究检测到完全性脊髓损伤后模型大鼠脊髓中Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白的表达明显升高，说明发生了脊髓组织中神经元的继发性凋亡；电针对Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白表达有明显抑制作用，结合脊髓凋亡情况的结果，说明电针可以通过降低脊髓凋亡率，缓解脊髓继发性凋亡，改善膀胱的神经支配，从而促进膀胱功能的恢复。

综上所述，本实验结果表明，骶上完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠的脊髓组织中凋亡细胞增加，且线粒体促凋亡途径Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9含量升高，激活凋亡程序引起细胞凋亡；电针次髎、中极、三阴交、大椎可减少脊髓组织中Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白的表达量，缓解脊髓继发性损伤，从而改善膀胱的神经支配，保护膀胱功能。本实验从线粒体途径Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白含量表达结合尿流动力学检测，部分说明电针对骶上完全性脊髓损伤后神经源性膀胱的治疗效果可能是通过改善膀胱神经支配而实现的，其上下游信号转导通路值得进一步研究。

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Effect of Electroacupuncture on Expression of Caspase-9,Cytochrome C and Apoptotic Protease Activating Factor 1 in Spinal Tissue in Rats with Neurogenic Bladder after Complete Spinal Cord Injury

XU Ming,ZHANG Hong,LIU Ji-sheng,YIN Xiu-ting,ZHANG Jian,HUANG Gui-lan,AI Kun
Hunan University of TCM,Changsha,Hunan 410208,China

ZHANG Hong.E-mail:zh5381271@sina.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture on Caspase-9,cytochrome C(Cyt-C)and apoptotic protease activating factor 1(Apaf-1)protein in rats with neurogenic bladder after complete spinal cord injury.Methods A total of 60 female Sprague-Dawley rats were involved,in which 36 rats were randomly selected to establish the neurogenic bladder model with T10spinal cord transected.24 successful models selected were randomly divided into model group(n=12)and electroacupuncture group(n=12).The other 24 rats were also randomly divided into sham group(n=12)and blank group(n=12).The electroacupuncture group was electroacupunctured on Ciliao (BL32),Zhongji(RN3),Sanyinjiao(SP6)and Dazhui(GV14)for seven days.All of them were assessed with urodynamic test,TUNEL method was used to determine the apoptosis rate of the spinal cord,and Western blotting was used to detect the expression of Caspase-9, Cyt-C and Apaf-1 protein.Results Compared with the blank group and the sham group,the maximum bladder capacity and compliance decreased(P＜0.01),the urinary bladder pressure and leakage point pressure increased(P＜0.05);the apoptosis rate of the spinal cord increased (P＜0.001);the expression of Caspase-9,Cyt-C and Apaf-1 protein increased(P＜0.05)in the model group and the electroacupuncture group. Compared with the model group,the maximum bladder capacity and compliance increased(P＜0.01),the urinary bladder pressure and leakage point pressure decreased(P＜0.05);the apoptosis rate of the spinal cord decreased(P＜0.05);the expression of Caspase-9,Cyt-C and Apaf-1 protein decreased(P＜0.05)in the electroacupuncture group.Conclusion Electroacupuncture on Ciliao,Zhongji,Sanyinjiao and Dazhui could improve the bladder function after spinal cord injury in rats.The mechanisms may be related with the down-regulation of Caspase-9,Cyt-C andApaf-1 protein to reduce apoptosis.

spinal cord injury;neurogenic bladder;electroacupuncture;Caspase-9;cytochrome C;apoptotic protease activating factor1;apoptosis;rats

R651.2

A

1006-9771(2017)06-0628-06

2016-10-17

2016-12-21)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.06.002

国家自然科学基金面上项目(No.81473753)。

湖南中医药大学，湖南长沙市410208。作者简介：许明(1990-)，男，汉族，湖南益阳市人，硕士研究生，主要研究方向：神经系统疾病的中西医结合康复机理与临床研究。通讯作者：张泓(1963-)，男，汉族，湖南常德市人，教授，博士研究生导师，主要研究方向：神经系统疾病的中西医结合康复机理与临床研究。E-mail:zh5381271@sina.com。