响应面法优化羰基还原酶产生菌Bacillusanthracis CGMCC No.12337的培养条件

欧志敏，徐佳慧，王 莹

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

响应面法优化羰基还原酶产生菌BacillusanthracisCGMCC No.12337的培养条件

欧志敏，徐佳慧，王 莹

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

炭疽芽孢杆菌BacillusanthracisCGMCC No.12337作为生物催化剂可不对称还原奥卡西平制备抗癫痫药物醋酸艾司利卡西平的关键中间体S-利卡西平.采用响应面优化法对B.anthracisCGMCC No.12337发酵培养基成分和培养条件进行优化，确定最优发酵条件为葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH 4.8，磷酸氢二钾0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，转速120 r/min，温度33 ℃，接种量10%，培养时间36 h.采用该优化培养方法，该炭疽芽孢杆菌产生的羰基还原酶活力达到了775.62 U/L，较优化前提高了35.12%.

炭疽芽孢杆菌；生物转化；响应面；培养条件

S-利卡西平是醋酸艾司利卡西平的关键手性中间体，同时也是奥卡西平的主要活性代谢产物[1-3].醋酸艾司利卡西平(S-(-)-10-乙酰氧基10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]氮杂-5-甲酰胺)作为钠离子通道抑制剂可用来治疗局限性及全身性的癫痫发作[4-5]，同时作为第二代抗癫痫药物，醋酸艾司利卡西平与奥卡西平相比能较好地防止毒性环氧代谢物的形成，因此醋酸艾司利卡西平拥有更好的稳定性和疗效[6].

采用立体选择性羰基还原酶产生菌炭疽芽孢杆菌BacillusanthracisCGMCC No.12337作为催化剂转化奥卡西平制备S-利卡西平具有立体选择性高、污染小和成本低等特点，符合环保，绿色的宗旨[7-8].为醋酸艾司利卡西平的合成提供了新的途径[9-10].本研究采用响应面分析方法对炭疽芽孢杆菌B.anthracisCGMCC No.12337的产酶条件进行优化.在单因素实验的基础上选用PB实验设计，以该菌株产生的羰基还原酶活力为响应值，对各因素的影响效应进行分析.采用最陡爬坡实验确定最大响应区域，采用响应面分析法确定最佳培养基成分和最优培养条件，优化该炭疽芽孢杆菌的产酶条件，为菌体的扩大培养和工业化应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

炭疽芽孢杆菌B.anthracisCGMCC No.12337由本实验室从浙江工业大学校园土壤中筛选得到，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心.

1.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖20 g/L，酵母浸出粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，硫酸镁0.25 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，琼脂20 g/L.

种子培养基：葡萄糖30 g/L，酵母浸出粉3 g/L，硫酸铵5 g/L，硫酸镁0.25 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L.

液体发酵培养基: 葡萄糖30 g/L，酵母浸出粉10 g/L，硫酸镁0.25 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L.

1.3 培养方法

斜面培养：将接有B.anthracisCGMCC No.12337的斜面试管放置于30 ℃的恒温培养箱中培养2～3 d，待菌落长出丰满的孢子.

种子培养：从斜面培养基中挑取一环接种到50 mL种子培养基中，30 ℃，120 r/min恒温摇床中培养24 h.

发酵培养：以10%的接种量将种子培养液接种到400 mL的发酵培养基中，30 ℃，120 r/min恒温摇床中培养24 h.

1.4 酶活力测定

取10 mL的发酵液于离心管中，8 000 r/min离心10 min，将离心所得菌体均匀分散在10 mL和pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入10 μmol 的奥卡西平，置于30 ℃，120 r/min恒温摇床中反应1 h.反应完成后将反应液置于离心管中，8 000 r/min离心10 min，取上清液.

用高效液相色谱法检测奥卡西平和S-利卡西平的含量，进一步计算B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力.以C-18(4 mm×250 mm×5 μm)作为色谱分析柱，检测波长215 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，流动相为V(乙腈)∶V(0.1%乙醇水)=40∶60.

B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力定义为在一定条件下，1 min内能将1 μmol的奥卡西平还原为S-利卡西平所需酶量为一个酶活力单位(U).

1.5 实验设计

1.5.1 单因素实验

在发酵培养基中，分别用30 g/L蔗糖、淀粉、乙醇等代替葡萄糖，其他成分不变.以10%的接种量接种于发酵培养基中，于30 ℃，120 r/min的摇床中恒温培养24 h，选择最佳碳源.在发酵培养基中分别用10 g/L蛋白胨、硫酸铵、尿素等代替酵母浸出粉，其他条件不变，以10%接种量接种于发酵培养基中，于30 ℃，120 r/min的摇床中恒温培养24 h，选择最佳氮源.

1.5.2 Placket-Burman 实验设计

Placket-Burman实验是一种两水平的实验设计方法，以期在众多的影响因素中找到少数几个重要的影响因子[11].本实验在单因素实验的基础上，初步确定葡萄糖质量浓度(A)、蛋白胨质量浓度(B)、初始pH(D)、转速(E)、温度(F)、接种量(H)、培养时间(J)和磷酸盐质量浓度(L)8个因素以及它们的取值范围，利用Placket-Burman实验设计，以期找到对酶活影响最大的3个因素.

1.5.3 最陡爬坡实验

为确保响应面拟合的准确性，需要找到最佳区域值[12-13]，显著因素根据一阶模型的回归系数的大小和符号确定爬坡梯度和方向[14].不显著因素则依据正效应因素取最高值，负效应因素取最低值的原则设计最陡爬坡实验.

1.5.4 Box-Benhnken实验设计

根据单因素和Placket-Burman筛选的3个重要因素以及最陡爬坡实验确定的中心范围，采用Box-Benhnken实验设计对B.anthracisCGMCC No.12337的产酶条件进行3因素3水平的响应面分析，确定B.anthracisCGMCC No.12337的最佳产酶条件.

1.5.5 验证实验

响应面优化得到的最优发酵培养基配方被用于配制炭疽芽孢杆菌B.anthracisCGMCC No.12337培养基并按优化后的发酵条件进行实验.检验发酵液中该炭疽芽孢杆菌的酶活性，并与理论值相比较，验证模型的有效性.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 碳源对B.anthracisCGMCC No.12337产羰基还原酶的影响

分别以30 g/L蔗糖、淀粉、乙醇、葡萄糖、β-环糊精为碳源，在其他培养基成分不变的情况下研究碳源的种类对B.anthracisCGMCC No.12337所产羰基还原酶活力的影响.实验结果如图1所示，当采用葡萄糖为碳源时，羰基还原酶的活力最高，因此选择葡萄糖为最佳碳源[15-16].

图1 不同碳源对菌株产酶活力影响Fig.1 Influence of different carbon sources on enzyme activity

2.1.2 氮源对B.anthracisCGMCC No.12337产羰基还原酶的影响

分别以10 g/L酵母浸出粉、牛肉膏、尿素、蛋白胨、硫酸铵为氮源，在其他培养基成分不变的情况下研究氮源的种类对B.anthracisCGMCC No.12337生产羰基还原酶酶活力的影响，实验结果如图2所示.当采用蛋白胨为氮源时，羰基还原酶的活力最高，因此选择蛋白胨为最佳氮源[17].

图2 不同氮源对菌株产酶活力影响Fig.2 Influence of different nitrogen sources on enzyme activity

2.2 Placket-Burman实验结果

根据单因素试验结果，选用试验次数N=12的实验设计,对葡萄糖质量浓度、蛋白胨质量浓度、初始pH、转速、温度、培养时间、接种量和磷酸盐质量浓度等8个因素进行考察，每个因素选取2个水平，实验结果见表1.

运用DX8.0对表1中的实验结果进行影响因子的显著性分析，分析结果如表2所示.结果表明：对B.anthracisCGMCC No.12337生产羰基还原酶影响最大的三个因素分别为葡萄糖质量浓度(A)，初始pH(D)和磷酸盐质量浓度(L)，得到一次线性回归方程式.

表1 Placket-Burman实验设计及结果

表2 各因素显著性分析结果

以B.anthracisCGMCC No.12337所产羰基还原酶活力为响应值的线性回归方程为

酶活力=850.333+6.907A-65.042D-10.017L

(1)

其中：A为葡萄糖质量浓度；D为初始pH；L为磷酸盐质量浓度.

由表3可看出：方差分析模型的Prob(P)>F的值小于0.000 1，表示该模型在回归区域有较好的拟合性.PB实验的复相关系数R2=0.926 5，表明实验数据的关联性较好；变化系数CV为9.57%，表明数据的可信度较高.校正决定系数R2=0.899，表示此回归模型可用来解释89.9%数据的变异性；精密度(Adeq precision)是有效信号和噪声的比值，超过4.0即为合理，实验精密度为16.762.

表3 回归方程的方差分析

2.3 最陡爬坡实验结果及分析

由Placket-Burman实验结果可知，葡萄糖质量浓度(A)，初始pH(D)，磷酸盐质量浓度(L)这三个因素对B.anthracisCGMCC No.12337生产羰基还原酶的影响显著.其中初始pH和磷酸盐质量浓度存在负显著效应，该结果表明B.anthracisCGMCC No.12337是一种嗜酸性的菌株，酸性的培养基有利于其生长和繁殖.葡萄糖质量浓度存在正显著效应，但需要考虑实际的生产成本.根据这3个因素的效应值大小和符号来设计最陡爬坡实验.实验设计及结果如表4所示，羰基还原酶活力在0+4x条件下达到最大值，之后开始降低，故最佳组合条件在0+4x附近，因此以0+4x的实验条件可作为响应面实验的中心点.

表4 最陡爬坡实验及结果

2.4 Box-Benhnken实验结果

根据Placket-Burman实验确定的影响B.anthracisCGMCC No.12337发酵的3个重要因素以及最陡爬坡实验确定的最优水平，以B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力为响应值进行3因素3水平的Box-Benhnken响应面分析实验，实验结果见表5.

表5 Box-Benhnken实验设计及结果

采用DX8.0软件对响应值以及各因素进行回归拟合分析，得到回归方程为

y=683.02+18.45A-57.36B-16.71C+51.22AB-18.22AC+6.01BC+42.60A2-29.90B2-4.58C2

(2)

其中：y为B.anthracisCGMCC No.12337的羰基还原酶活力；A，B，C分别为葡萄糖质量浓度、初始pH和磷酸盐质量浓度.根据式(2)，得到最佳酶活力为776.98 U/L.

表6为响应面方差分析，R2=0.973 2表示该模型拟合性较好，自变量与响应值之间的线性关系达到显著.该方差分析结果还表明初始pH的一次项，葡萄糖质量浓度的二次项均达到了极显著水平(P<0.01).此外，葡萄糖质量浓度和初始pH的交互作用也很显著.

表6 二次响应面回归模型方差分析1)

注：1)*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01.

根据响应面分析和回归方程利用DX8.0软件绘制出响应面分析图，见图3.

图3 葡萄糖质量浓度、初始pH和磷酸盐质量浓度对菌株酶活力影响的响应面图Fig.3 Response surface of interactive effects of glucose, initial pH and phosphate concentration

由响应面图3可知：葡萄糖质量浓度，初始pH和磷酸盐质量浓度存在显著相关性并且都存在极值.采用DX8.0软件对B.anthracisCGMCC No.12337所产的羰基还原酶活力进行分析，当酶活力达到最大值776.98 U/L时，葡萄糖质量浓度为41.97 g/L，初始pH 4.83，磷酸盐质量浓度为0.5 g/L.

2.5 培养基及其发酵条件的最优组合

通过单因素实验，Placket-Burman实验设计，响应面回归分析和实际因素分析，确定最优培养基为：葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH 4.8，磷酸氢二钾0.5 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L.最优发酵条件为转速120 r/min，温度33 ℃，接种量10%，培养时间36 h.

2.6 发酵条件验证实验结果

为了验证回归模型预测结果的准确性，在此优化条件下共进行3次发酵实验，B.anthracisCGMCC No.12337发酵液的平均酶活力达到了775.62 U/L，与理论值相比，其相对误差为1.75%，表明该模型能较好地模拟和预测实验结果.因此，响应面优化得出的对B.anthracisCGMCC No.12337发酵培养条件的参数准确可靠，证实了模型的有效性[18].

3 结 论

利用单因素实验和Placket-Burman实验设计，得到葡萄糖质量浓度，初始pH和磷酸盐质量浓度是影响B.anthracisCGMCC No.12337发酵产酶的三个显著因素.通过最陡爬坡实验确定这3个因素的最优值范围.采用BBD设计和DX8.0软件进行分析，得到B.anthracisCGMCC No.12337的最佳培养条件：葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH4.8，磷酸氢二钾0.5 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L，转速120 r/min，温度33 ℃，接种量10%，培养时间36 h.在此优化条件下，B.anthracisCGMCC No.12337的羰基还原酶活性达到了775.62 U/L，较优化前提高了35.12%.表明采用响应面优化法是寻找菌株最佳产酶条件的有效途径.本研究的实验结果为B.anthracisCGMCC No.12337不对称还原奥卡西平制备S-利卡西平奠定了基础.

[1] 胡伟，谢建伟，蒋祖林，等.抗癫痫药物奥卡西平的合成[J].化工生产与技术，2010,17(4):35-37.

[2] MODUKURU N K, SUKUMARAN J, COLLIER S J，et al. Development of a practical，biocatalytic reduction for the manufacture of (S)-Licarbazepine using an evolved ketoreductase[J]. Organic

process research & development,2014(18):810-815.

[3] 王宇春，邢爱敏.抗癫痫药醋酸艾司利卡西平[J].药学进展，2009，33(12)：571-573.

[4] OU Z M, SHI H B, SUN X Y, et al. Synthesis of S-licarbazepine by asymmetric reduction of oxcarbazepine withSaccharomycescerevisiaeCGMCC No. 2266[J]. Journal of molecular catalysis b: enzymatic,2011,72(5):294-297.

[5] 赵蕾蕾，杜小莉，徐小薇.新型抗癫痫药醋酸艾司利卡西平[J].中国新药杂志，2004,23(21):2461-2464.

[6] 饶志方，王婉钢.治疗癫痫新药醋酸艾司利卡西平研究进展[J].中国药师，2015,18(3):471-473.

[7] 王玉.不对称还原前手性芳香酮微生物的筛选[D].武汉:武汉大学,2010.

[8] 胡海峰，朱宝泉.微生物在药物开发中的应用[J].中国天然药物，2006，4(3)：168-171.

[9] SINGH M, SINGH S, DESHABOINA S, et al. Asymmetric reduction of a key intermediate of eslicarbazepine acetate using whole cell biotransformation in a biphasic medium[J]. Catalysis science & technology,2012(2):1602-1605.

[10] RAVINDER B, REDDY S R, SRIDHAR M, et al. An efficient synthesis for eslicarbazepine acetate, oxcarbazepine and carbazepine[J]. Tetrahedron letters,2013,54(7):2841-2844.

[11] 代志凯，张翠，阮征.设计实验和优化及其在发酵培养基优化中的应用[J].微生物学通报，2010,37(6):894-903.

[12] 胡丽娟，薛高尚，卢向阳，等.响应面法优化芽孢杆菌25-2产纤维素酶发酵条件[J].酿酒科技，2012(4)：21-26.

[13] 郝学财，余晓斌，刘志钰，等.响应面法在优化微生物培养基中的应用[J].食品研究与开发，2006,27(1):38-40.

[14] 张泽生，祖玉姣，余悦，等.响应面法优化春雷霉素发酵培养基及培养条件[J].中国抗生素杂志，2014,39(8):584-589.

[15] 梅建凤，金航，李靓，等.生物转化法提高积雪草中积雪草酸的质量分数[J].浙江工业大学学报，2015,43(5):573-577.

[16] 沈佳佳，张晓军，汪圣华，等.微生物发酵法长环氧化物水解酶的研究[J].浙江工业大学学报，2006,34(2):131-136.

[17] 章小洪，汪琨，朱延恒，等.解淀粉芽孢杆菌BW-13培养基的培养条件优化[J].浙江工业大学学报，2013,41(1):36-39.

[18] 闻崇炜，刘瑞江，毛春友.响应面分析法优化重组原动蛋白2β诱导条件的研究[J].生物技术通报，2012(5):173-178.

(责任编辑：刘 岩)

Optimization of fermentation condition for stereoselectivity carbonyl reductase producing strainBacillusanthracisCGMCC No.12337 by response surface methodology

OU Zhimin, XU Jiahui, WANG Yin

(College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

S-licarbazepine was synthesized by asymmetric reduction of oxcarbazepine withBacillusanthracisCGMCC No.12337 as catalyst. S-licarbazepine is the key intermediate of antiepileptic drug eslicarbazepine acetate. Response surface analysis method was used to optimize fermentation medium and conditions forB.anthracisCGMCC No.12337. The optimum fermentation conditions were finally conformed as: 42 g/L glucose, 20 g/L peptone, pH 4.8, K2HPO40.5 g/L, KH2PO40.5 g/L, 120 r/min, 33 ℃, 10% inoculation and 36 h. Under the optimum conditions, the maximum enzyme activity ofB.anthracisCGMCC No.12337 reached 775.62 U/L, with an increase of 35.12% compared to the original fermentation condition.

BacillusanthracisCGMCC No.12337; biotransformation; response surface; fermentation conditions

2016-10-25

浙江省自然科学基金资助项目(LY15B060005)

欧志敏(1973—)，女，辽宁铁岭人，教授，博士，研究方向为生化制药和酶工程，E-mail:oozzmm@zjut.edu.cn.

R971.6

A

1006-4303(2017)03-0279-06