吡啶硫酮金属对华美盘管虫(Hydroides elegans)精子DNA的损伤效应

陈新，李紫薇，覃宗敏，商群，唐敏,*

1. 海南大学材料与化工学院，海口 5702282. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228

吡啶硫酮金属对华美盘管虫(Hydroides elegans)精子DNA的损伤效应

陈新1，李紫薇2，覃宗敏1，商群1，唐敏1,*

1. 海南大学材料与化工学院，海口 5702282. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228

吡啶硫酮铜(CuPT)和吡啶硫酮锌(ZnPT)在渗出型海洋防污涂料中的应用日益广泛，其生态毒性引起了人们的关注。本文以南海海域常见优势种——华美盘管虫(Hydroides elegans Haswell)为试验动物，采用彗星实验研究了吡啶硫酮金属对华美盘管虫精子细胞DNA的损伤情况。结果显示，低浓度(4 μg·L-1CuPT或8 μg·L-1ZnPT)处理组的精子细胞，其“彗星”尾长、尾DNA含量及Olive尾矩都显著高于溶剂对照组(P<0.05)；较高浓度(8 μg·L-1或16 μg·L-1CuPT，16 μg·L-1或32 μg·L-1ZnPT)处理组的精子细胞，其“彗星”尾长和尾矩多数显著高于溶剂对照组(P<0.01)。此外，尾长和Olive尾矩在试验浓度范围内都呈现“效应-浓度”正相关。CuPT为4 μg·L-1、ZnPT为8 μg·L-1时，对精子DNA造成轻度损伤；CuPT为8 μg·L-1、16 μg·L-1，ZnPT为16 μg·L-1、32 μg·L-1时，则达到了中度损伤的程度。可见吡啶硫酮金属具有较明显的海洋生态遗传毒性；另一方面，华美盘管虫精子细胞DNA对吡啶硫酮金属的胁迫呈现出较高的敏感性和效应-浓度相关性，在作为生态遗传毒性的生物指标方面具有潜在优势，进一步的研究将促进其在海洋重金属污染评价中的应用，特别是用于南海海洋环境的早期预警监测。

吡啶硫酮金属；华美盘管虫；精子；生态遗传毒性

海洋资源开发已经成为众多沿海国家发展战略的重要组成部分，我国制定的“十三五”规划和“一带一路”建设目标，使海洋成为开拓发展的新空间，为我国经济和社会发展提供了更多的契机。然而，值得关注的是随之带来的一系列海洋生态环境问题亟待解决，这在我国一些局部海域非常严峻。其中重金属污染问题特别突出，它在海洋环境中残余时间长、生物毒性效应明显、沿食物链易富集、难以治理，对海洋生物和人类健康危害性很高，一直是海洋生态环境学领域研究的热点之一[1]。特别是很多有机重金属，例如有机汞和有机锡[2-3]都曾给海洋生态和人类健康带来过严重危害。近来吡啶硫酮金属在海洋防污产品应用广泛，作为防污助剂的含量通常占10%以上[4-5]，同时也因其优良的抗菌性能大量应用于抗菌防霉涂料、护发去屑品等化工产品中[6]。已有研究表明吡啶硫酮锌对淡水生物麦穗鱼、青鳉、直突摇蚊亚科2龄幼虫属剧毒物质[7]，对海水多毛类Dinophilus gyrociliatus的生存和生殖都会带来负面影响[8]。为了及时而客观地评价吡啶硫酮金属的生态风险，有必要对其进行系统而全面的生态毒性研究。

华美盘管虫(Hydroides elegans)属管栖多毛类，分布广泛，生活史短，在我国南海全年都能繁殖、附着，且易在实验室养殖，对很多污染物敏感，是较理想的生态毒性检测生物[9-13]。此外，热带海洋多毛类华美盘管虫是南海污损生物群落常见优势种，在当地防污工作方面备受关注。Bao等[9]研究了无机铜、吡啶硫酮铜(CuPT)、吡啶硫酮锌(ZnPT)、敌草隆对华美盘管虫担轮幼虫的急性毒性作用，发现48 h半致死浓度(LC50)分别为100、5.7、7.6、16 000 μg·L-1；重金属也会阻碍华美盘管虫受精过程，导致发育停止，以及胚胎及幼虫出现畸形发育，华美盘管虫不同生命阶段对重金属表现出不同的敏感性[10-12, 14]；此外，华美盘管虫配子受精及胚胎发育对氟氯青霉素也较敏感[15]；Thilagam等[16]利用处于早期生命阶段的华美盘管虫作为指示生物，评价了印度东海岸不同水域的生态毒性现状。上述研究大多集中在毒物对华美盘管虫个体生长发育的影响，对其生态遗传毒性方面的报道很少。已知环境中具有遗传毒性的物质会损伤生物的遗传物质，加大生物的遗传负荷，从而给生物种群以及生态系统的遗传方面带来深远的负面影响，所以水生生态遗传毒性的研究在水质质量监测和生态风险评价中具有重要意义[17]。

目前对DNA损伤程度进行检测的遗传毒性方法主要分为2类：(1)从DNA损伤引起的生物学效应来进行检测，如染色体畸变、细胞突变分析、微核试验等；(2)直接对DNA损伤进行检测，如单细胞凝胶电泳(也称为彗星实验)、沉降技术、洗脱技术等。其中单细胞凝胶电泳应用最为广泛，实验操作较简单、快速灵敏，可在单个细胞水平检测DNA损伤[18-19]，在生态遗传毒性检测领域有很好的应用前景[20-22]，在溞、软体动物、鱼等水生生物的多种细胞中获得了较满意的检测结果[23-24]。但是在水生生态遗传毒性研究和应用过程中，彗星实验在程序标准化、提高结果重复性、增强结果的可比性、从机理角度进行结果解释等方面还需进一步的优化和完善。Sunjog等[25]分别使用鲢鱼(Squalius cephalus L.)红细胞、鳃细胞和肝细胞进行彗星实验以检测河水及水库淡水的潜在遗传毒性，发现彗星尾矩和尾长度是评价DNA损伤的灵敏参数。Pellegri等[17]研究了大型溞(Daphnia magna)血淋巴细胞彗星实验的操作程序，期望加快其在淡水生态遗传毒性检测的标准化进程。另外，Speit等[26]认为使用生殖细胞进行遗传毒性研究具有更重要的意义。

本文以海洋多毛类华美盘管虫为实验动物，利用彗星实验研究了吡啶硫酮金属对华美盘管虫精子DNA的损伤情况，以了解CuPT和ZnPT对华美盘管虫的遗传毒性效应，探讨CuPT和ZnPT对华美盘管虫精子的毒性作用机理，期望为加快无脊椎动物生殖细胞彗星实验在海洋生态遗传毒性领域的应用以及在结果解释方面提供参考资料。

1 材料与方法(Materials and methods)

实验用华美盘管虫成体采集于海南陵水黎安湾(18°30′N，110°01′E)，年平均水温为25.5 ℃，盐度为35‰，pH为8.2。

参照文献[10]方法培养华美盘管虫成体，先用过滤(0.45 μm)后的采集地海水，次日及以后均采用人工海水(所用海盐购于青岛海之盐水族科技公司)半量换水进行培养。连续充气，每日早晚投饵1次，饵料为牟式角毛藻(Chaetoceros muelleri)(海南大学海洋学院藻种室提供)，密度约为5×104cells·mL-1，每天观察并记录华美盘管虫及其水质状态。

1.2 实验方法

1.2.1 获取华美盘管虫精子

采取机械方式破坏华美盘管虫栖息的石灰质管，因应激反应[10-11]处于繁殖成熟期的虫体在数分钟内会释放大量配子。用400目筛网过滤精子溶液，再用冷冻离心机离心2次(SIGMA 3k-18，4 000 r·min-1，2 min)，去上层液体，将精子用适量过滤海水重悬。血球计数板计数，用过滤海水稀释到6×104sperm·μL-1。

1.2.2 精子染毒处理

利用二甲基亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich Co. LLC)作为助溶剂分别配制1 g·L-1的CuPT和ZnPT(上海广拓化学)母液，避光保存。试验时采用人工配制海水稀释到相应浓度。实验所用试剂均为分析纯。

企业应制定简洁的工作流程，这也是提高工作效率、缩短时间成本的一项措施。拖沓冗长的环节程序不仅会降低工作效率，还会影响外界与企业的正常衔接，产生不必要的时间成本。

分别吸取50 μL精子溶液(6×104sperm·μL-1)，暴露于不同浓度的待检溶液中，参照文献[10]数据，CuPT和ZnPT分别设定3个浓度处理组，CuPT浓度为4.00、8.00、16.00 μg·L-1，ZnPT浓度为8.00、16.00、32.00 μg·L-1，海水为空白对照组，DMSO为溶剂对照组(0.07 mL·L-1)。参考美国环境保护署(EPA)对无脊椎动物海胆精子的毒性试验[27-28]，选择室温黑暗条件下染毒处理1 h后，离心(4 000 r·min-1，22 ℃，2 min)，弃去上清液，加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液，混匀。取少量精子细胞悬浮液进行台盼蓝染色，计算细胞存活率。

1.2.3 彗星试验

实验步骤参照文献[29]方法稍作修改。以1%正常熔点琼脂糖和0.7%低熔点琼脂糖在磨砂载玻片上铺胶，三层胶中底胶为正常熔点琼脂糖，中层为混合细胞的低熔点琼脂糖，上层为低熔点琼脂糖。在4 ℃条件下凝固后，在新鲜配制并预冷的细胞裂解液(2.5 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Na2EDTA，10 mmol·L-1Tris，0.2 mmol·L-1NaOH，体积分数为10%的DMSO，体积分数为1%的TritonX-100，pH=10)中，4 ℃避光裂解4 h。随后用预冷的去离子水充分漂洗。在20 V、300 mA条件下电泳20 min。

在0.4 mmol·L-1Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液，4 ℃条件下中和15 min。取出载玻片后，采用SYBR Green I(Invitrogen)染液避光染色。使用荧光显微镜(OLYMPU BX51)，选择波长495 nm，进行细胞观察和拍照。每一对照组和处理组都在200×下随机统计分析50个细胞图像，利用CASP软件分析，测量彗星细胞的头长和全长、尾长和尾矩。

1.3 数据统计与分析

用Excel 2010进行数据整理，利用SPSS 19.0分析实验组与对照组各相关数据。数据结果显示为平均值±标准误差(用误差线显示)，P < 0.05、P < 0.01为差异显著。

2 结果(Results)

华美盘管虫精子细胞的台盼蓝染色结果显示细胞存活率为92.4%～95.8%，细胞密度为2×106cells·mL-1，细胞存活率和密度达到了彗星实验要求。

在荧光显微镜下观察对照组和各处理组精子细胞(图1)，发现空白对照组的精子核紧密而集中，边缘较清晰，尾部很短或没有出现明显的尾部(图1A)；溶剂对照组的精子核形态与和空白对照类似(图1B)。CuPT处理组(C～E)和ZnPT处理组(F～H)的“彗星”尾长与溶剂对照组相比明显变大，且不同毒物处理组随着毒物浓度的增加都出现“彗星”头部变小、头部亮度变弱、尾长增加，同时尾部荧光强度逐渐增强的趋势。

海水空白组(图2中以0表示)和溶剂对照组(图2中以DMSO表示)精子细胞的“彗星”尾长、尾DNA含量及Olive尾矩均无显著差异。处理组中较低浓度(4 μg·L-1CuPT和8 μg·L-1ZnPT)的精子细胞的“彗星”尾长、尾DNA含量及Olive尾矩显著高于溶剂对照组(P<0.05)，处理组中较高浓度(8 μg·L-1和16 μg·L-1CuPT，16 μg·L-1和32 μg·L-1ZnPT)的精子细胞，其“彗星”尾长、尾DNA含量和尾矩多数是显著(P<0.01)高于溶剂对照组的(图2)。分别比较CuPT和ZnPT处理组的精子细胞“彗星”的尾长、尾DNA含量和尾矩，可见尾长、尾DNA含量和尾矩在试验浓度范围内都呈现效应-浓度正相关，相关系数r在0.985～0.996范围内。CuPT为4 μg·L-1、ZnPT为8 μg·L-1时，彗星尾DNA百分比含量分别为15.16%和16.69%，按照Anderson等[30]对DNA损伤的分级标准，达到了轻度损伤的程度；CuPT为8 μg·L-1、16 μg·L-1，ZnPT为16 μg·L-1、32 μg·L-1时，彗星尾DNA百分比含量分别为23.38%、34.96%和27.30%、37.83%，则达到了中度损伤的程度。

图1 华美盘管虫精子细胞彗星图像(×200)注：A-海水空白组；B-溶剂对照组；C, D, E分别为4 μg·L-1、8 μg·L-1和16 μg·L-1 CuPT处理组；F, G, H分别为8 μg·L-1、16 μg·L-1和32 μg·L-1 ZnPT处理组。Fig. 1 The comet image of sperms of Hydroides elegans (×200)Note: A-the blank; B-solvent control; C, D, E stand for the treatment groups with 4 μg·L-1, 8 μg·L-1 and 16 μg·L-1 of CuPT respectively; F, G, H stand for the treatment groups with 8 μg·L-1, 16 μg·L-1, 32 μg·L-1 of ZnPT, respectively.

3 讨论(Discussion)

从实验结果可知，与空白对照相比，助溶剂DMSO在实验浓度范围对精子DNA损伤无显著影响；在CuPT和ZnPT的胁迫下，华美盘管虫精子细胞DNA损伤显著提高，并且随着CuPT和ZnPT浓度的增加，精子细胞DNA损伤程度提高，两者呈正相关。

图2 CuPT/ZnPT对华美盘管虫精子细胞DNA的损伤作用注：*、**与对照组比较差异显著P<0.05、P<0.01。Fig. 2 DNA damage of Hydroides elegans sperm following the exposure to CuPT/ZnPTNote: Compared with the control, *, ** stand for the significant differences at the level P<0.05, P<0.01.

重金属对动物细胞DNA的损伤机制目前还未完全解析，有专家研究认为重金属诱导自由基是DNA损伤一个重要因素，已知重金属会破坏或抑制很多动物的抗氧化防御系统，导致自由基增加，自由基攻击DNA链而导致DNA分子断裂，在不能及时修复的情况下出现DNA片段[36]；此外，彗星实验已应用于抗氧化剂效应检测，这也进一步肯定了自由基对DNA的损伤作用[37]；CuPT和ZnPT对华美盘管虫的抗氧化系统具有较明显的影响，抗氧化系统受损后不能及时清除过多的自由基[38]，故推测本实验中CuPT和ZnPT对DNA的损伤效应与抗氧化系统受损和自由基的积累是密切关联的。对于吡啶硫酮金属对华美盘管虫的生态毒性效应及其机理，还有待更加深入的研究，如吡啶硫酮金属在华美盘管虫体内的输送和代谢规律、吡啶硫酮金属及其代谢物与生物活性大分子物质的相互作用、吡啶硫酮金属的联合毒性以及与其他污染物对华美盘管虫的复合效应等。在此领域的深入研究，有望为探索无脊椎动物在海洋环境监测以及防污剂生态遗传毒性评价中作为实验动物提供参考数据。

彗星实验在脊椎动物遗传毒性检测方面的研究和应用较多，对无脊椎动物的研究相对较少，而且多采用体细胞[39-41]。海洋环境中无脊椎动物种类丰富，数量庞大，是海洋生态系统中最主要的消费者，在物质循环和能量流动过程中承担重要作用。体外受精现象在海洋无脊椎动物繁殖过程中普遍存在，释放到体外的精子直接与海水接触，易受到环境中有毒物质的影响。若在环境因子的胁迫下无脊椎动物精子DNA的完整性受到破坏，将不可避免地影响到精子的健康和存活，进而限制该动物种群的发展，并可能由此对局部区域生态系统的健康和可持续发展产生潜在的深远影响。所以，以海洋无脊椎动物精子细胞作为遗传毒性检测对象具有明显的优势。本实验采用彗星实验，以南海近岸常见的无脊椎动物——华美盘管虫精子细胞为遗传毒性检测对象，发现较低浓度的CuPT(8 μg·L-1)或ZnPT(8、16 μg·L-1)即可对华美盘管虫精子细胞DNA产生中度损伤，呈现出较高的敏感性，这在南海海洋生态环境评价中具有一定的现实意义，也为今后发展合理快速的生态遗传毒性检测方法提供参考资料。

综上所述，利用彗星实验研究了CuPT和ZnPT对华美盘管虫精子细胞DNA的损伤情况。结果表明，一定浓度CuPT和ZnPT均能引起华美盘管虫精子细胞DNA的损伤，并且在一定范围内，尾长、尾DNA含量和Olive尾矩与吡啶硫酮金属浓度呈明显的剂量-效应关系，即随着浓度增大，对精子细胞DNA的损伤程度明显增加；华美盘管虫精子细胞对CuPT的敏感性高于ZnPT。CuPT为4 μg·L-1、ZnPT为8 μg·L-1时，对DNA造成轻度损伤；CuPT为8 μg·L-1、16 μg·L-1，ZnPT为16 μg·L-1、32 μg·L-1时，则达到了中度损伤的程度。对于吡啶硫酮金属对华美盘管虫的生态毒性机理还有待进一步的深入探究，这将促进其作为生物标志的应用进程。

致谢：感谢海南大学分析测试中心；感谢邱立国、朱秀琴等同学在试验中给予的帮助，特别感谢审稿专家和编辑提出的宝贵意见。

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The Effects of Metal Pyrithione on Sperm DNA of PolychaeteHydroideselegans

Chen Xin1, Li Ziwei2, Qin Zongmin1, Shang Qun1, Tang Min1,*

1. College of Material and Chemical Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China2. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China

13 October 2016 accepted 2 December 2016

The application of copper pyrithione (CuPT) and zinc pyrithione (ZnPT) are increasingly widespread in exudation antifouling coatings, and their potential ecotoxicity has attracted a plethora of concerns. In this paper, the effects of CuPT and ZnPT on sperm DNA damage of Hydroides elegans were investigated by comet assay. Results indicated that in groups with low concentration of CuPT (4 μg·L-1) or ZnPT (8 μg·L-1), the length of comet tail, DNA contents in tail, and comet Olive tail moment were significantly greater than that of the control (P<0.05), and also those in the higher concentration groups (CuPT at 8 μg·L-1or 16 μg·L-1, ZnPT at 16 μg·L-1or 32 μg·L-1) were significantly greater than that of the control (P<0.01). A positive “concentration-effect” relationship was observed within the concentration range of this experiment. When CuPT and ZnPT were at 4 μg·L-1and 8 μg·L-1, respectively, DNA damage occurred in a slight degree, while at 8 μg·L-1and 16 μg·L-1CuPT or 16 μg·L-1and 32 μg·L-1ZnPT, moderate DNA damage was detected, indicating that CuPT and ZnPT could have obvious ecogenotoxicity in marine environment. In addition, the results also illustrated that Hydroides elegans sperm were sensitive to stress caused by CuPT and ZnPT, and therefore such test can be considered as a potential biomarker for ecogenotoxicity assessment of marine pollution caused by heavy metals, especially for early alert in the South China Sea.

metal pyrithione; Hydroides elegans; sperm; ecogenotoxicity

国家自然科学基金项目(31360105，31660128，31160098)

陈新(1973-)，男，讲师，研究方向为海洋环境与生态毒理，E-mail: 982912387@qq.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: 1251054716@qq.com

10.7524/AJE.1673-5897.20161013001

2016-10-13 录用日期：2016-12-02

1673-5897(2017)2-201-08

X171.5

A

唐敏(1972-)，女，博士，副教授，主要研究方向为水生生态学，发表学术论文40余篇。

陈新, 李紫薇, 覃宗敏, 等. 吡啶硫酮金属对华美盘管虫(Hydroides elegans)精子DNA的损伤效应[J]. 生态毒理学报，2017, 12(2): 201-208

Chen X, Li Z W, Qin Z M, et al. The effects of metal pyrithione on sperm DNA of polychaete Hydroides elegans [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 201-208 (in Chinese)