3种杀菌剂及其复配剂对斑马鱼的急性毒性

瞿唯钢，杨淞霖，王会利，郭宝元,*

1. 中国农业部农药检定所，北京 1001252. 中国科学院生态环境研究中心，北京 100085

3种杀菌剂及其复配剂对斑马鱼的急性毒性

瞿唯钢1，杨淞霖2，王会利2，郭宝元2,*

1. 中国农业部农药检定所，北京 1001252. 中国科学院生态环境研究中心，北京 100085

采用“半静态法”测定了3种农药及其复配剂对斑马鱼的24 h、48 h、72 h和96 h急性毒性，根据我国《化学农药环境安全评价实验准则》中毒性等级划分标准来划分它们对斑马鱼的毒性等级，发现35%精甲霜灵悬浮种衣剂的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50均超过10 a.i.mg·L-1，属“低毒”级，而25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分别为0.704 mg·L-1、0.514 mg·L-1、0.424 mg·L-1、0.262 mg·L-1，根据0.100 a.i.mg·L-1

农药；斑马鱼；急性毒性；半静态法

近年来，为了保证作物的正常生长和产量，农药的使用量越来越大，尤其是发展中国家，如印度。初步估计15%左右的作物产量损失由病虫害引起，这也是农药使用越来越广泛的原因之一。但与此同时，残留在作物或者土壤中的农药由于雨水和地表径流进入附近的水体中，对水体中的生物产生影响。尽管水体中的生物大部分并不是农药的靶标生物，短时间内并没有产生致死等现象，但随着水体中农药的累积，可能会造成生物繁殖能力下降、生长速率改变、抵御自然变化(pH、温度和溶解氧)的能力下降等[1]，进而威胁整个生态环境。

农药的环境污染及风险已经引起了我国政府乃至国际的重视，尤其是对水生生物的污染及风险。目前我国颁布的《化学农药环境安全评价试验准则》中第12部分“鱼类急性毒性试验”专门针对农药对于水体中鱼类的毒性风险做出了实验示范，而美国对于农药生态风险评价历史较长，评价模式较为完善，因而我们也参照了美国的“生态风险评价基准”[2]，其中生态受体主要选择鱼类和无脊椎动物中的浮游动物，而斑马鱼是最常用的受体，故我们选择斑马鱼作为本研究的受试动物。

精甲霜灵((R)-N-(2,6-二甲苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-D-丙胺酸甲酯，metalaxyl-M)，属于苯基酰胺类杀菌剂，对卵菌菌丝生长、休止孢萌发均具有很强的抑制作用，有良好的内吸传导性能，对晚疫病有优异的预防、治疗和铲除作用[3]，可用于种子、土壤处理及茎叶处理，主要用于防治瓜果、蔬菜的霜霉病、疫病及马铃薯晚疫病等[4]。

咯菌腈(4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧-4-基)吡咯-3-腈，fludioxonil)属于吡咯类杀菌剂，杀菌作用机理独特，对灰霉病菌具有很高的抑菌活性[5]，常用来防治番茄、黄瓜、韭菜、草莓和莴苣等多种蔬菜的灰霉病[6]。

嘧菌酯((E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，azoxystrobin)是甲氧基丙烯酸酯类杀菌农药，高效、广谱，对几乎所有的真菌界(子囊菌亚门、担子菌亚门、鞭毛菌亚门和半知菌亚门)病害如白粉病[7]、锈病、颖枯病、网斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性。可用于茎叶喷雾、种子处理，也可进行土壤处理，主要用于谷物、水稻、花生、葡萄、马铃薯、果树、蔬菜、咖啡、草坪等。

而嘧菌酯、咯菌腈和精甲霜灵复配使用常用于种子处理，可防治大部分种子带菌及土壤传染的真菌病害[8-9]。以上3种农药均在农业生产中广泛使用，这些农药在使用后极易随地表径流进入水体中，因而衡量它们对水体中生物的影响显得尤为重要。但目前还未有报道研究它们对斑马鱼的潜在危害，本文为了给水生生物安全评价提供新的毒理学数据，也为了更好地保护生物多样性，对此展开了专门的毒理学研究。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 斑马鱼

试验用斑马鱼(Brachydanio rerio)购自北京中蔬大森林花卉交易市场，批次为AS08P150806。试验之前在与试验环境相同条件下饲养12 d。然后在温度为21～25 ℃，光暗比为16 h:8 h的条件下驯养7 d，试验前24 h停止饲喂。

1.2 药剂

35%精甲霜灵悬浮种衣剂(由农业部提供)；25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂(由农业部提供)；80%嘧菌酯水分散粒剂(由农业部提供)；11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂(由农业部提供)。

1.3 实验方法

1.3.1 试验用鱼驯养

试验前，挑选足够数量斑马鱼，在试验条件下驯养7 d，每天饲喂2次刚孵化的丰年虫幼体，试验前24 h停止饲喂。驯养一周死亡率为0%，死亡率未超过5%，试验前抽检数量为10%的斑马鱼(10尾)，测量体长、体重，体长在1.7～2.3 cm范围内，承载量<1.0 g鱼·L-1，符合试验要求。

1.3.2 毒性测试

试验依据我国《化学农药环境安全评价试验准则》[10]第12部分“鱼类急性毒性试验”，农药环境评价良好实验室规范[11]，水质-物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法[12]，化学品-鱼类急性毒性试验[13]，ISO[14]以及OECD[15]关于斑马鱼急性毒性测试方法来进行。

采用半静态法对斑马鱼进行染毒。35%精甲霜灵悬浮种衣剂设定的5个处理组浓度，分别为20、40、60、80、100 a.i.mg·L-1；25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂设定的5个处理组浓度分别为0.180、0.234、0.304、0.395、0.514 a.i.mg·L-1；80%嘧菌酯水分散粒剂设定的5个处理组浓度分别为1.30、1.95、2.93、4.40、6.60 a.i.mg·L-1；11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂设定的5个处理组浓度分别为1.00、1.20、1.45、1.75、2.10 a.i.mg·L-1；，以曝气自来水为空白对照，对照组和处理组均不设重复，每组加入10尾斑马鱼。

试验周期为96 h，每隔24 h更换原有药液，每隔24 h测定溶液的pH值、温度、溶解氧含量(DO)。

分别在0 h与24 h更换试验溶液之前从各处理组取100 mL的供试物溶液，于冰箱中冻存，用于供试物含量的测定。

观察距试验开始24 h、48 h、72 h、96 h时间间隔后各组斑马鱼中毒与死亡情况。

1.3.3 数据处理

以药剂浓度的对数值为自变量(x)，以相应浓度下斑马鱼死亡率的几率值为因变量(Y)，采用SPSS数据处理软件及Probit程序进行回归分析，建立“剂量-效应”线性方程，计算出LC50(或LD50)值及其95%置信限。

1.3.4 毒性等级划分标准

根据我国《化学农药环境安全评价实验准则》[10]中对鱼类的毒性等级划分标准来划分4种农药对斑马鱼的毒性等级，见表1。

2 结果(Results)

2.1 3种供试农药及其复配剂对斑马鱼的24 h、48 h-LC50

3种农药及其复配剂对斑马鱼的24 h、48 h毒性测定结果如表2所示，35%精甲霜灵悬浮种衣剂的5个试验浓度处理组在24 h、48 h内斑马鱼未发生死亡，说明35%精甲霜灵悬浮种衣剂在24 h、48 h内对斑马鱼的LC50均大于100 a.i.mg·L-1。25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂在24 h、48 h内对斑马鱼的LC50分别是0.704 mg·L-1和0.514 mg·L-1。由此可以看出对斑马鱼25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂比35%精甲霜灵悬浮种衣剂毒性大。而80%嘧菌酯水分散粒剂在24 h、48 h内对斑马鱼的LC50分别是9.803 mg·L-1和5.175 mg·L-1；11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂在24 h、48 h内对斑马鱼的LC50分别是2.267 mg·L-1和2.073 mg·L-1。可以看出，11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂的3种组分中咯菌腈毒性最强，精甲霜灵最弱。所以11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂的毒性主要源于咯菌腈。

表1 毒性等级划分标准Table 1 Toxicity grading standards

2.2 3种供试农药及其复配剂对斑马鱼的72 h、96 h-LC50

3种农药及其复配剂对斑马鱼的72 h、96 h毒性测定结果如表3所示，35%精甲霜灵悬浮种衣剂的5个试验浓度处理组在72 h、96 h内斑马鱼仍未发生死亡，说明35%精甲霜灵悬浮种衣剂在72 h、96 h内对斑马鱼的LC50均大于100 a.i.mg·L-1，满足LC50(96 h)>10.0 a.i.mg·L-1，属“低毒”级。25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂在72 h、96 h内对斑马鱼的LC50分别是0.424 mg·L-1和0.262 mg·L-1，其LC50(96 h)在0.100～1.00 a.i.mg·L-1范围内，属于“高毒”级别。80%嘧菌酯水分散粒剂在72 h、96 h内对斑马鱼的LC50分别是4.328 mg·L-1和2.326 mg·L-1，其LC50(96 h)在1.00～10.0 a.i.mg·L-1范围内，属“中毒”级。11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂在72 h、96 h内对斑马鱼的LC50分别是1.62 mg·L-1和1.28 mg·L-1，其LC50(96 h)在1.00～10.0 a.i.mg·L-1范围内，属“中毒”级。虽然11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂和80%嘧菌酯水分散粒剂同属“中毒”，但比较具体数值，发现11%精甲霜灵·咯菌腈·嘧菌酯悬浮种衣剂毒性相对更大，可能是因为其中含有“高毒”的咯菌腈。

3 讨论(Discussion)

35%精甲霜灵悬浮种衣剂对斑马鱼的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50均超过10 a.i.mg·L-1，属“低毒”级，而25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂对斑马鱼的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分别为0.704 mg·L-1、0.514 mg·L-1、0.424 mg·L-1、0.262 mg·L-1，根据0.100 a.i.mg·L-1

同一种农药对不同的生物的毒性是不同的，没有所谓的毒性一定更强的农药，每种农药的毒性作用机制不同导致它对不同生物毒性不同。因而在开发新的农药时，除了要考虑对靶标生物的杀灭效果，满足人们防治病虫害的效果，还要考虑农药对环境中其他生物可能的毒害作用，以免给生态环境带来大的风险。同时应尽可能使用混剂，一方面可以减少各单剂的剂量，还可以达到多种效果，同时，人们还发现农药混剂可以降低生物抗药性[16]。可以在一定程度上缓解农药用量快速增长，给生态环境带来的巨大压力。

致谢：该项目得到国家自然科学基金No.21477152和No.21277163的支持。

表3 “半静态法”测得的3种农药及其复配剂对斑马鱼的72 h、96 h-LC50Table 3 The 72 h and 96 h LC50 values of the studied pesticides to Brachydanio rerio by semi-static method

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◆

The Toxicity of Three Pesticides of Mefenoxam, Fludioxonil, Azoxystrobin and Their Compounds to Brachydanio rerio

Qu Weigang1, Yang Songlin2, Wang Huili2, Guo Baoyuan2,*

1. Institute for Control of Agrochemicals, Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

1 April 2016 accepted 23 May 2016

Semi-static method was applied to determine the 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values of three pesticides and their compounds to Brachydanio rerio. And according to experimental criteria for environmental safety evaluation of chemical pesticides in our country, the 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values of 35% mefenoxam seed coating agent are all above 10 a.i.mg·L-1so it is of low toxicity. 25 g·L-1fludioxonil seed coating agent is highly toxic because its 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values are 0.704 mg·L-1, 0.514 mg·L-1, 0.424 mg·L-1, 0.262 mg·L-1according to the standard of 0.100 a.i.mg·L-1

pesticide; Brachydanio rerio; acute toxicity; semi-static method

国家自然科学基金(21477152，21277163)

瞿唯钢(1958-)，男，农艺师，研究方向为农药环境毒理研究与农药登记管理，E-mail: quweigang@gmail.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: guoby@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160401008

2016-04-01 录用日期：2016-05-23

1673-5897(2017)2-233-05

X171.5

A

郭宝元(1976-)，副研究员，主要研究方向为农药环境毒理学。

瞿唯钢, 杨淞霖, 王会利, 等. 3种杀菌剂及其复配剂对斑马鱼的急性毒性[J]. 生态毒理学报，2017, 12(2): 233-237

Qu W G, Yang S L, Wang H L, et al. The toxicity of three pesticides of mefenoxam, fludioxonil, azoxystrobin and their compounds to Brachydanio rerio [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 233-237 (in Chinese)